Szemészet, 2002 (139. évfolyam, 1-4. szám)

2002-03-01 / 1. szám

58

Szemészet

CHAPS-puffer esetén nem kaptunk enzimaktivitásra utaló jelet. HL-60-extraktum esetén DNS-létrát detektáltunk, melynek fokai - felfelé haladva - egyre több telomert tartalmazó szekvencia képét mutatták. A retinoblastoma-minta esetén tehát volt telomerjel, míg a hőkezelt mintánál ezt nem láttuk, de a gél felső részén a degradált hosszabb DNS-szakaszoknak megfelelő sávok a pozitív aktivitást jelölhetik. Két melanoma malignum chorioideae-ből származó mintát is megfuttattunk. A folyadék-szcintillációval telomeráz-pozitivitást mutató minta gélelektroforézissel is pozitív jelet adott.

A folyadék-szcintillációval negativitást mutató minta gélelektroforézissel sem mutatott aktivitást.

Megbeszélés

Az elmúlt években számos metodikát dolgoztak ki a telomerázaktivitás kimutatására, illetve kvantitatív meghatározására.91016,17 Minden mérési eljárás azon alapszik, hogy a telomeráz enzim meghosszabbít egy oligonukleotid prímért a telomerszekvenciák beépítésével. Az így keletkezett elsődleges produktum közvetlenül detektálható (konvencionális módszer) vagy PCR (polimeráz láncreakció) - amplifíkálást követően válik mérhetővé. A telomerázaktivitás kvantitatívan a primerek meghosszabbításából származó, beépült telomerszakaszok összmennyiségével jellemezhető. A telomerázaktivitás tehát függ az enzim processzivitásától, vagyis attól, hogy átlagosan hány darab telomerikus ismétlődéssel hosszabbodnak meg a primerek, valamint függ az enzim átvételi arányától, azaz adott idő alatt menynyi prímért hosszabbít meg az enzim.8

A telomeráz enzim kutatásában nagy áttörést jelentett a PCR alapú telomerázmérési módszer, az úgynevezett TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) assay kifejlesztése.10 Ezen módszer nagyságrendekkel megemelte a telomerázaktivitás mérésének érzékenységét.

A PCR alapú telomerázmérési eljárásból kiindulva egy egyszerűsített protokollt dolgoztunk ki. A Kim és mtsai által bevezetett TRAP assay-nek kifejlesztettük egy módosított változatát, amelynél a telomeráz-produktumok hossza nem változott a PCR-amplifikálás során. Ez a módosított protokoll alkalmasnak bizonyult a telomeráz processzivitásának meghatározására is.16'17

A módszert eddig még a szemészeti tumorok telomerázaktivitásának kimutatására nem alkalmazták. Saját vizsgálatainkban ezzel az új TP-TRAP eljárással sikerült a telomeráz enzimet kimutatni az intraocularis, valamint a szem környéki tumorból származó mintákból.

Az irodalmi adatok alapján a szemészeti tumor kutatásban a telomeráz enzim szerepét uvealis melanoma malignumok és retinoblastoma eseteiben vizsgálták.7,14

A jelen tanulmány vizsgálati eredményei az irodalmi adatokkal nem teljesen korrelálnak. Heine és mtsai minden vizsgált melanoma esetében pozitív telomerázaktivitást detektáltak.7 Rohrbach tanulmányában a melanoma malignumból származó tumorminták 90%-ában talált telomerázreaktivitást.14 Saját vizsgálatainkban az igazolt melanoma malignumok 58,3%-a bizonyult telomeráz-pozitívnak. Valószínűleg a metodikák különbözősége magyarázza az eltérést. A retinoblastomák vizsgálata során mind

a hőkezelt, mind a nem hőkezelt minták értékelése során magas dpm-értékeket kaptunk, de pozitívnak csak az egyik minta bizonyult. A Gupta és mtsai által végzett vizsgálatok szerint a telomerázaktivitás hiányában, illetve a még meglevő hosszú telomerláncok esetében is a retinoblastoma5 növekedésre képes. Valószínűnek tartjuk, hogy a vizsgált retinoblastomás mintáinkban is ez a jelenség magyarázza a két teljesen különböző aktivitási értéket.

Az általunk vizsgált különböző tumortípusok eltérő arányban mutattak aktivitást. A nem hőkezelt tumorminták radioaktivitása a hőkezeitekhez képest legnagyobb arányban a basaliomák eseteiben volt emelkedett. Ennek oka a telomeráz enzim reaktivációjának különböző mértéke lehet. A kapott eredményekre irodalmi vonatkozás nem ismert. A mai modern molekuláris biológiai módszerek továbbfejlődésével már a telomerázt expresszáló géneket is tudják részben azonosítani, illetve klónozni.18

Ettől a módszerek további finomítása, a szenzitivitás fokozódása várható a közeljövőben.

A nem tumoros szemészeti szövetminták telomerázaktivitását csak az utóbbi időben vizsgálták.3,13 Az enzimet cornealis endothelsejtekből és pterygiumból detektálták. A cornealis endothelsejtekben nem mutatott aktivitást az enzim.3 A pterygium eseteiben a szerzők felvetik a reaktiválódott telomeráz patogenetikai szerepét is a kórkép kialakulásában.13

Lavelle és mtsai összefoglaló tanulmányukban az eddigi ismeretek összegzéseként felvetik annak lehetőségét, hogy a telomer/telomeráz támadáspont (target) a 3. évezred tumorterápiájának alapköve lehet. A különböző stratégiai lépések lehetnének: a telomeráz direkt inhibíciója, a telomerek közötti interferencia és egyéb telomerekkel való interakció.

Mind a saját eredmények, mind az irodalmi adatok alapján úgy véljük, hogy az új telomeráz enzim assay (TPTRAP) vizsgálat a jövőben fontos diagnosztikus és prognosztikai markerré válhat a szemészeti tumorok eseteiben.

Irodalom

1. Cerni C.: Telomeres, telomerase, and myc. An update. Mutat Res 462 (1), 31-47 (2000).

2. Dhaene К., Van Marek E., Parwaresch R.: Telomeres, telomerase and cancer: an up-date. Virchows Arch 437(1), 1-16 (2000).

3. Egan C.A., Savre-Train I., Shay J.W., Wilson S.E., Bourne W.M.: Analysis of telomerase lengths in human comeal endothelial cells from donors of different ages. Invest Ophthalmol Vis Sei 39(3), 648- 653 (1998).

4. Greider C.W., Blackburn E.H.: The telomer terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell 51, 887-898 (1987).

5. Gupta J„ Han L.P., Wang P, Gallie B.L., Bacchetti SDevelopment of retinoblastoma in the absence of telomerase activity. J Natl Cancer Inst 88(16), 1152-1157 (1996).

6. Harrington L.A., Greider C.W.: Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature 353, 451-454 (1991).

7. Heine B., Coupland S.E., Kneiff S., Demel G., Bornfeld N., Hummel M„ Stein H.: Telomerase expression in uveal melanoma. Br J Ophthalmol 84, 217-223 (2000).

8. Holt S.E., Shay J.W.: Role of telomerase in cellular proliferation and cancer. J Cell Physiol 180, 10-18 (1999).

Kemény-Beke Adám