Szemészet, 2002 (139. évfolyam, 1-4. szám)
2002-03-01 / 1. szám
56 §g§§§j Szemészet Thumb telomer polimeraz dómén telomeráz RNS 1. ábra. A telomeráz enzim szerkezete A telomeráz kvantitatív detektálása azonban meglehetősen bonyolult feladat a sejtekből, szövetekből kinyerhető enzim csekély aktivitása miatt. Végül Kim és mtsai 1994- ben kifejlesztettek egy PCR (polymerase chain reaction) alapú telomerázmérési módszert, a TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) assay-t.10 Ez a szenzitív módszer lehetővé tette a telomerázmérést kisméretű tumorok esetében is, például akár 100 sejtből álló szolid daganatokból is. E módszert alapul véve munkacsoportunk kidolgozott egy módosított, egyszerűbb telomerázmérési protokollt, a TP-TRAP-t (two primer-TRAP).16,17 A szemészeti tumorok eseteiben a telomeráz enzim szerepéről kevés irodalmi adat ismert.7,14 Ezen közlemények az eredeti mérési assay-n alapulnak.10 Munkánkban a tumorminták telomeráz aktivitásának mérésére az új protokollt használtuk.16 A munkacsoportunk által módosított, kvantitatív meghatározásra kiválóan alkalmas mérési protokollt elsőként alkalmaztuk szemészeti tumorok eseteiben. Az új diagnosztikai módszer lehetővé teszi a daganat rendkívül kis mérete esetén is (néhány mikrogramm) a telomerázaktivitás detektálását. 2. A telomerázaktivitás detektálása A telomerázméréshez szükséges oligonukleotidokat laboratóriumunkban szintetizáltuk a Pharmacia Gene Assembler Plus oligonukleotidszintetizáló készüléken. A PCR-reakcióhoz felhasznált primerek tisztítása gélelektroforézissel történt. A telomerázmérésekhez felhasznált oligonukleotidok: MTS primer: 5 ’ -AGCATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ’ RP primer: 5' -TAG AGC AC AGCCTGTCCGTG-3 ’ RPC3 primer: 5 ’ -TAG AGC AC AGCCTGTCCGTG (СТА ACC)3-3 ’ A telomerázaktivitást az általunk módosított PCR alapú, kvantitatív mérési módszerrel határoztuk meg.16,17 A mérés egyszerűsített elve a 2. ábrán látható. E módszer esetén a PCR-reakció nagy részében a reverz primer nem random módon, hanem csak a DNS- fragmentek terminális régiójához kötődik, így a létrejövő PCR-termékek hossza jól reprezentálja a telomeráz enzim által generált repeat-ek hosszát. A keletkező PCR-terméket 5%-os TCA-val csaptuk ki, a precipitátumot GF/C üvegszűrőn izoláltuk, a csapadék radioaktivitását folyadék-szcintillációs méréssel határoztuk meg. A tumorminták esetében a detektálás érzékenységének növelése érdekében a PCR-ciklusszámot a legtöbb esetben megemeltük 27-ről 29-re. A TP-TRAP összefoglaló lépéseit a 2. ábra tartalmazza. Összesen 24, szemészek által eltávolított, különböző régióból származó tumorminta került feldolgozásra. Tizennégy intraocularis tumorból valamint tíz szemhéjon és periorbitalisan elhelyezkedő tériméből származó mintát használtunk. A végleges diagnózist a kórszövettani feldolgozás után állapítottuk meg. A vizsgálat menetének algoritmusát a 3. ábrán tüntettük fel. Tekintettel a minták alacsony számára, statisztikai analízist nem végeztünk. Néhány kontroll vizsgálat esetén a radioaktív jelölést elhagytuk és a PCR-produktumokat 10%-os poliakrilamid gélen választottuk el (futtatás 2 órán át, 300 V-n). A szétvá-Anyag és módszer 1. Telomerázt tartalmazó extraktumok készítése Vizsgálataink előtt számos sejtvonalat teszteltünk és végül a HL-60 (human promyelocytás leukaemia) sejtet választottuk, mivel könnyen tenyészthető és magas a telomerázszintje. Ezekből, illetve a Szemészeti Klinika műtéti anyagából származó tumorszövetekből telomerázt tartalmazó sejt-, illetve szövetextraktumokat készítettünk. Az extraktumok készítéséhez a Kim és mtsai által bevezett detergens lízis módszert alkalmaztuk.10 A minták proteinkoncentrációját Bio-Rad protein-assay segítségével határoztuk meg. A minták intaktságának ellenőrzésére megmértük ALP (alkalikus foszfatáz) aktivitásukat. Csak azon minták szerepeltek a későbbi vizsgálatokban, amelyek detektálható ALP aktivitással rendelkeztek. MTS primer 1 . elongacio telomerazzal (30 percig, 30 C-on) -------------------------------------------► I 1-2 PCR-ciklus alacsonyabb hőmérsékleten-4-----------------------------------RPC3 primer 3-29 PCR-ciklusok magasabb hőmérsékleten ▼ ◄----------------------------------MTS primer RP primer-------------------► 2. ábra. A TP-TRAP assay alapelve Kemény-Beke Adám
