Szemészet, 2001 (138. évfolyam, 1-4. szám)
2001-03-01 / 1. szám
Szemészet 6 lyamat. A tartósított corneák felhasználása egészen más laboratóriumi hátteret, előkészületeket és természetesen más műtéti technikákat igényel. A kísérletsorozat célja az volt, hogy klinikai felhasználás előtt a Magyarországon jelenleg beszerezhető corneakonzerváló folyadékokat összehasonlítsuk. Két középtávú konzerváló folyadékot (Likorol [Chauvin-Opsia, Franciaország] és Optisol [Chiron Ophthalmics, USA]), valamint két középhosszú távú médiumot (Inosol [Chauvin-Opsia] és Iscove’s Modified Dulbecco Medium [IMDM, Sigma, USA]) vizsgáltunk. A négyhetes vizsgálat során meg kívántuk határozni a centrális cornealis endothelium sejtszámának és morfológiájának változását. Szintén nyomon akartuk követni a szaruhártyák anyagcsere-változását és az oldatok esetleges kontaminációját. A vizsgálati idő végén pedig a különböző módon tartósított corneákat szövettani vizsgálatnak vetettük alá. A vizsgálat végső célja az volt, hogy ezen adatok alapján megpróbáljuk a szaruhártya-átültetésekhez legjobban megfelelő konzerváló oldatot kiválasztani. Módszerek A két középtávú (Optisol és Likorol) és a két középhosszú távú (Inosol és IMDM) corneatároló folyadékban 8-8, összességében 32 normális humán szaruhártyát konzerváltunk négy héten (28 nap) keresztül. A kísérletsorozatban használt corneák átlagéletkora 56 év volt (a legidősebb donor 76 éves, a legfiatalabb 28 éves volt). A halál és az enucleatio közt eltelt idő átlagosan 7 óra (legkevesebb 0,5 óra, legtöbb 10 óra) volt. A fél órával a halál után eltávolított donorszövet multiorganikus vesedonorból származott. A halál és a corneoscleralis excisio között átlagosan 8,7 óra (legkevesebb 0,5 óra, legtöbb 14 óra) telt el. A kísérletsorozat minden lépését a sterilitás szabályait követve, lamináris bokszban végeztük, illetve készítettük elő. A középtávú médiumokat +4 °C-on hűtőszekrényben, a középhosszú távú oldatokat pedig +37 °C-on 5%-os telítettségű C02- termosztátban tároltuk. Endothelsejt-morfológia és endothelsejtszám: A centrális cornealis endotheliumot a konzerválás előtt, valamint a 7., a 14., a 21. és a 28. napon fáziskontraszt inverz mikroszkópiával vizsgáltuk. Ehhez a vizsgálathoz a corneákat endothelialis oldallal felfelé steril Petri-csészében helyeztük el, és 1 percig 0,4%-os vitális tripánkék festékkel festettük. A 28. nap után az endothelium pontosabb vizsgálatához egyperces alizarinvörös-festést is alkalmaztunk, amely nemcsak a sejtközötti állományt, hanem az elhalt sejteket és sejtmagokat is megfesti. (Utóbbi módszert azért csak a 28. nap után alkalmaztuk, mert az alizarinvörös toxikus hatású.) A festés után előkészített corneákat a Petricsészében helyeztük a mikroszkóp alá. A mikroszkóphoz csatolt videokamera a látott képet monitoron is megjelenítette. Ezzel egy időben a képernyőre vetítettük azt az előzetesen Bürker-kamra segítségével kalibrált négyzethálót is, amelynek felhasználásval a sejtszámolást végeztük. A sejtszámlálást és az endothelmorfológia megítélését a kísérletsorozat időtartama alatt egy ugyanazon vizsgáló végezte, a comea centrális részén legalább három különböző látómező sejtszámátlagát véve figyelembe. Biokémiai vizsgálatok: Ugyancsak a fent említett 7 napos periódusban a comea anyagcseréjének indirekt nyomon követéséhez meghatároztuk a konzerváló médiumok átlagos glükóz- és laktátszintjét enzimatikus módszer segítségével. Mikrobiológiai vizsgálatok: a 0., 7., 14., 21. és a 28. napon mintát vettünk a tápfolyadékokból Transpocult táptalajra (Espoo, Finnország) leoltva, az esetleges aerob, anaerob és gombás fertőzés kimutatására. Hisztológiai vizsgálatok: A 4 hetes periódus végén a corneákat középen kettévágtuk, felét fény-, felét elektronmikroszkópos feldolgozásnak vetettük alá. Mindkét esetben konvencionális hisztológiai módszereket követtünk: fénymikroszkópos vizsgálat során formalinfixálás és paraffinbeágyazás, majd hematoxilin-eozin és PAS-festés történt. Az elektronmikroszkópos mintákat 2,5%-os glutáraldehidben fixáltuk, majd 1%-os ozmium-tetroxidos utórögzítést követően Durcupan gyantába ágyaztuk. Statisztika: A leíró statisztikai adatokat az átlag és a szórás numerikus és grafikus megjelenítésével jellemeztük. Az egyes oldatok időbeni változó értékeit (sejtszám, glükóz- és laktátszint) Wilcoxon-teszt segítségével vetettük össze. Korrelációs analízishez meghatároztuk a korrelációs koefficienst (r) Spearman szerint. A p<0,05 értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Eredmények Endothelsejt-morfológia és endothelsejtszám (1. ábra és 1. táblázat) Optisolban konzervált corneák esetében az átlagos centrális endothelium sejtszám hét nap eltelte után 4000/mm2- ről 3060/mm2-re (p=0,01), a 14. napra 2500/mm2-re csökkent (p=0,01). A harmadik héten a sejtszám nem mutatott további csökkenést (2520/mm2, p=0,22), a 28. napon már csak 1940/mm2 (p=0,01) volt az átlagos sejtsűrűség. Likorol oldat esetében az első hét végére a kezdeti átlagos 3880/mm2 sejtszám 3450/mm2-re csökkent (p=0,01), a 14. napon 2800/mm2 (p=0,01), a 21. napon 1960/mm2 (p=0,01), a 28. napon 610/mm2 (p=0,01) volt az endothelsejtsűrűség. 1. táblázat. Az átlagos endothelsejtszám változása a négy különböző konzerváló folyadékban a kezdeti és a négyhetes vizsgálati periódusban (zárójelben a szórásértékekkel) 0. hét l.hét 2. hét 3. hét 4. hét Optisol 4000 (64,6) 3060 (31,8) 2500 (103) 2520 (97,5) 1940 (58) Likorol 3880 (96,7) 3450 (53,1) 2800 (76,1) 1960 (53,9) 610 (80,2) IMDM 3640 (129,2) 3360 (101,1) 3140 (135,8) 3180 (85,5) 2740 (80) Inosol 3060 (106,6) 2750 (90) 2350 (98,1) 2300 (93,3) 2200 (85,2) Módis László
