Szemészet, 1991 (128. évfolyam, 1-4. szám)
1991-12-01 / 4. szám
146 Szemészet, 128 (1991) végeztük 12%-os lapgélen. Az elektroforézis befejezését követően a géllapokat fixáltuk, Coomassie-kékkel megfestettük, majd a felesleges festék kimosását követően autoradiográfiát készítettünk. A különböző [32P]-vel jelölődött fehérjéket az autoradiográfia segítségével beazonosítottuk, majd a gélből kivágva meghatároztuk radioaktivitásukat. A foszfátbeépülést pmol 32P/mg fehérje egységekben adtuk meg. Eredmények A humán lencsemembrán elektroforézisét követően, mind a normál, mind a kataraktás lencsék esetében 2 fő polipeptidláncot találtunk a gélen, melyek molekulasúlya 26 és 18 kDa-nak felelt meg. A molekulasúlyok alapján a két fehérjét az MP26- nak és az MP18-nak tekintettük. Ezen két fő polipeptidlánc mellett, kisebb mennyiségben, még további fehérjekomponensek is észlelhetőek voltak a gélen (a normál lencsékben 22 kDaos, a kataraktás lencsékben 21 kDa-os tartományban). Takemoto és mtsai (14), valamint Garner és mtsai (5) szerint ezek a 21-22 kDa tartományba eső proteinek szoros rokonságban vannak az MP26 membránfehérjével, tulajdonképpen ennek proteolitikus degradációjával keletkeznek. Az in vitro fehérje foszforilációt követően mindkét exogén proteinkináz (cAMP-függő és a proteinkináz C) két fő fehérjét foszforilált a lencsemembránban (I. táblázat). Ezek a foszfoproteinek a molekulasúlyuk alapján, egyértelműen az MP26 és MP18 fehérjéknek feleltek meg. Az MP26 esetében azt találtuk, hogy a katarakta kialakulása lényegesen csökkentette a fehérjefoszfát inkorporációját (I. táblázat), ami valószínűleg részben az MP26 degradációjának a következménye. A kataraktás lencsékben az MP26 mennyiségi csökkenése a gélelektroforézist követő Coomassie-kék festés után is egyértelműen észlelhető volt. Ugyanakkor a kísérletek egyik legérdekesebb megfigyeléseként azt tapasztaltuk, hogy az MP26 degradációs termékei (21-22 kDa tartomány) gyakorlatilag nem foszforilálódtak egyik proteinkináz hatására sem. I. táblázat A cAMP-függő proteinkináz (PK-A) és a proteinkináz C (PK-C) hatása a lencsefehérjék foszforilációjára in vitro. Az eredmények két kísérlet átlagai pmol 32P/mg fehérjeértékekben kifejezve. ND = nem detektálható. Fehérje Kontrol-lencsék Kataraktás lencsék PK-A PK-C PK-A PK-C 26 kDa (MP26) 4.9 3.4 2.0 0.8 22 kDa <0.5 <0.5 ND ND 21 kDa ND ND <0.5 <0.5 18 kDa (MP18) 7.2 4.2 7.4 4.0 Megbeszélés A foszforilációs és defoszforilációs folyamatokat úgy tekinthetjük, mint a különböző fehérjék funkcionális szabályozásának egyik fontos mechanizmusát (1, 4, 7). Jelen közleményünkben egyértelműen igazolni tudtuk, hogy a humán lencsemembrán két fő fehérjekomponense - az MP26 és MP18 proteinek - in vitro körülmények között jól foszforilálódtak mind a cAMP- függő proteinkináz-enzimmel, mind a proteinkináz C-vel. Ugyanakkor az MP26 fehérje degradációs termékei (21-22 kDa proteniek) nem voltak foszforilálhatóak egyik exogén kináz enzimmel sem. Úgy tűnik, hogy az MP26 fehérje öregedés és kataraktogenesis során bekövetkező degradációja együtt jár a foszforilációs helyek elvesztésével. Hasonló adatokat észleltek a különböző emlős lencsékből preparált MP26 mesterséges proteolízisét követően is (10). Az emlős lencserostok erősen differenciálódott sejtek és a különböző proteinkinázok és foszforproteinek jelenléte egyértelműen valószínűsíti a foszforilációs folyamatok regulatorikus szerepét (8, 11). Tekintettel arra, hogy a humán lencsemembrán két fő komponense foszfoprotein, kézenfekvő, hogy a foszforilációs folyamatok valamilyen membránfunkciót szabályozhatnak. Újabban egyre több adat utal arra, hogy az MP26 és MP18 foszforilációja az úgynevezett lencsecsatornák (gap junctions) anyagáramlását szabályozza (1). így az is könnyen érthető, hogy a katarakta kialakulása során az MP26 fehérje mennyiségének, illetve foszforilálhatóságának csökkenése együtt jár a membránfunkció károsodásával. Az MP26 és MP18 fehérjék szerepének további tisztázására a jövőben in vivo foszforilációs vizsgálatokat tervezünk [32P]ortofoszfáttal jelölt humán lencsefragmentumokon. Irodalom 1. Facskó A: A fehérje foszforilációs folyamatok jelentősége a lencsében. Szemészet 126, 199 (1989). 2. Facskó A: Phosphorylation of human lens membrane proteins by various protein kinases in normal and cataractous lenses. Euroage in press. 3. Galvan A, Lampe PD, Hur КС, Howard JB, Eccleston ED, Arneson M, Louis CF: Structural organization of the lens fiber cell plasma membrane protein MP18. J. Biol. Chem. 264, 19974 (1989). 4. Garland D, Russel P: Phosphorylation of lens fiber cell membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 653 (1985) . 5. Garner MH, Roy D, Spector A: Immunochemical characterization of the main intrinsic proteins of the human lens membi ne. Exp. Eye Res. 34, 781 (1982). 6. Goodenough DA: Lens gap j> ctions: a structural hypothesis for non-regulated low-resistance intercellular pathways. Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 18, 1104 (1979). 7. ' nsr-KR, Panter SS, Johnson RG: Phosphorylation of lens merne a cyclicAMP-dependent protein kinase purified from the be Biochim. Biophys. Acta 844, 367 (1985). 8. Johnson К R, I Hur КС, Louis C F, Johnson RG: A lens intercellular juncti MP26, is a phosphoprotein. J. Cell. Biol. 102, 1344 (1986).f UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of tne head of bacteriophage T4. Nature 227, 680 (1970). 10. Lampe PD, Bazzi AID Nelsestuen GL, Johnson, RG: Phosphorylation of lens intrinsic proteins by protein kinase C. Eur. J. Biochem. 156, 351 (1986). 11. Lampe PD, Johnson, RG: Phosphorylation of MP26, a lens junction protein, is enhanced by activators of protein kinase C. J. Membrane Biol. 107, 145 (1989). 12. Peterson GL: A simplification of the protein assay method of Lowry et al., winch is more generally applicable. Anal. Biochem. 83, 346 (1977). 13. Salama S: A rapid preparation of human platelet calcium-activated phospholipid-dependent protein kinase. Thromb. Res. 44, 648 (1986). 14. Takemoto L, Takehana M: Major intrinsic polypeptide (MIP26) from human lens membrane: characterization of low-molecular-weight forms in the aging human lens. Exp. Eye Res. 43, 661 (1986) . Cím: Dr. Facskó Andrea, SZOTE Szemészeti Klinika, 6701 Szeged, Pf. 407.
