Buicu, Florin - Cristea, Doina (szerk.): Satu Mare. Studii şi comunicări. Seria ştiinţele naturii 9. (2008)
Medicină
Satu Mare - Studii şi Comunicări Seria Ştiinţele Naturii\io\. IX (2008) SUA) prin tehnica “sandwich” pe ambele părţi ale capului pancreatic (implantare ortotopică) precum şi în peritoneu şi pe stratul muscular abdominal, imediat sub piele (implantare heterotopică). Plăcuţele au fost ataşate prin suturi fine cu polipropilén 5/0 (Prolene, Ethicon, Norderstedt, Germania). i PMMA este un material biocompatibil utilizat în oftalmologie şi urologie0). Distanţele standard de 3 mm între cele două plăcuţe de PMMA au fost menţinute de 3 tuburi fine de silicon (diametru 0,8 mm). A fost recoltat aproximativ 1 mm3 de ţesut tumoral dintr-o tumoră primară a unui şobolan şi implantată în pancreas sau intraperitoneal, între cele două plăcuţe. Abdomenul a fost închis, iar animalele au fost trezite. Microscopia intravitală a fost efectuată la 4 săptămâni după inoculare. Tumora a fost de aproximativ 4-6 mm în diametrul maxim, împrejmuită de plăcuţe la acel moment. Atât ariile centrale cât şi cele periferice au fost accesibile examenului microscopic intravital. După 4 săptămâni, toate animalele au fost reanesteziate aşa cum s-a descris anterior. Un cateter de teflon (diametrul intern 0,5 mm, B.Braun AG, Melsungen, Germania) a fost introdus în vena jugulară internă pentru abord venos. Un alt cateter a fost plasat în artera carotidă stângă pentru recoltări sanguine şi monitorizarea parametrilor cardiovasculari. Abdomenul a fost deschis printr-o incizie mediană. Animalul a fost plasat într-un loc special şi menţinut artificial la 37°C. Tumora a fost identificată macroscopic. Suprafaţa portantă a tumorii a fost imobilizată într-o cameră de imersie cu temperatură controlată (37°C) ce conţine soluţie Ringer, întreaga etapă de microscopie intravitală a fost efectuată cu un microscop fluorescent (Leica GmbH, Wetzlar, Germania). Au fost folosite 2 blocuri de filtre fluorescente: 13 (filtru de excitaţie BP450-490; filtru de emisie LP520) şi N2.1 (filtru de excitaţie BP515-560, filtru de emisie LP580). Pentru obţinerea unui contrast maxim al morfologiei vasculare şi pentru măsurarea diametrului vascular au fost administrate 50 mg/kg corp albumină marcată cu fluoresceină izotiocianată (A-9771, Sigma Chemicals Co., St. Louis, SUA). La sfârşitul experimentului, animalele au fost sacrificate cu o supradoză de pentobarbital. Suprafaţa portantă a tumorii a fost recoltată şi fixată în formol 10% pentru investigaţii histologice ulterioare şi confirmarea prezenţei tumoraié în suprafaţa respectivă. Diametrul vaselor în microcirculaţia tumorală şi în pancreasul normal au fost evaluate folosind un software special (Capimage, Zeintle GmbH, Heidelberg, Germany). Piese din tumoră au fost tăiate în secţiuni histologice de 8 □ m pentru măsurarea densităţii vasculare. Pentru evaluarea densităţii vasculare,.fiecare secţiune necolorată a fost divizată în 6 câmpuri microscopice periferice şi 3 câmpuri microscopice centrale, în raport cu volumul tumoral. Deoarece toate vasele sanguine au fost umplute cu soluţie fluorescentă colorantă, administrată anterior, densitatea vaselor a fost cuantificată cu un software comercial (Capimage, Zeintl GmbH, Heidelberg, Germania), folosind o scală gri, superpozabilă pe toate ariile fluorescente, aceasta fiind exprimată ca şi procentaj al suprafeţei tisulare. Pentru compararea microvascularizaţiei pancreasului normal, au fost analizate 6 pancreasuri normale, pregătite în acelaşi mod. Au fost examinate la un microscop optic secţiuni histologice de 5 □ m din tumoră. Imaginea histologică a fost transmisă printr-o videocameră la un monitor şi înregistrată (a un videorecorder. Suprafaţa secţiunii transversale a tumorii a fost măsurată ulterior folosind acelaşi software special. Apoptoza tumorală a fost colorată prin metoda TUNEL (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germania). Au fost calculate numărul de celule tumoraié apoptotice şi numărul total de celule. Apoptoza a fost exprimată ca şi procent din totalul celulelor tumoraié. Datele au fost analizate folosind software SAS (SAS Institute Inc., Cary, SUA). Toate datele sunt date ca medie (deviaţie standard), în afara celor care au fost indicate în alt mod. Testul Student, Anova sau testul Mann-Whitney U au fost folosite pentru evaluarea semnificaţiei diferenţelor dintre grupuri; probabilitatea mai mică de 0,05 a fost acceptată ca semnificativă. Rezultate Au fost identificate caracteristicile tipice ale microvascularizaţiei tumoraié în cancerul de pancreas. S-a constatat dispariţia anatomiei normale a arteriolei, capilarului şi venulei, aşa cum poate fi găsită în marea majoritate a ţesuturilor sănătoase, inclusiv în pancreasul exocrin (Figura 1). 66
