203982. lajstromszámú szabadalom • Eljárás újszülött borjak Rotavírus és Escherichia coli mikroorganizmusok okozta hasmenéses megbetegedése elleni inaktivált, adjuvált, bivalens oltóanyag előállítására
1 HU 203 982 B 2 A találmány szerinti eljárással előállított oltóanyag bővíti az állatgyógyászati készítmények választékát, és nagy előnye, hogy egyetlen készítmény alkalmazásával jelentős mértékben visszaszorítható, vagy megelőzhető az újszülött boijak rotavíms és E. coli okozta járványos megbetegedése. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél az NCAIM B (P) 001098 szám alatt 1989. 09. 19-én letétbe helyezett ST+ K99 antigénszerkezetű E. coli törzsből egy foszfát, pepton, élesztőkivonat, glükóz és nyomelem tartalmú táptalajon 37 °C hőmérsékleten, rázott tenyészettel készült inokulum felhasználásával az inokulumnál használt táptalajjal megegyező közegben végzett fermentálással, bakterilógiai és spektrofotometriás ellenőrzés mellett tiszta baktériumtenyészetet állítunk elő. A tenyészetet mertiolat (nátrium-etil-merkuri-tioszalicilát) oldat hozzáadásával inaktiváljuk. Az inaktivált baktériumtenyészetet tartalmazó fermentlevet ülepítő centrifugán való kezeléssel töményítjük, majd a tömény szuszpenzió nyíróigénybevételes - mechanikus kezelésével a baktériumtestek felszínéről a pilusokat leválasztjuk és azokat az így pilusmentesített baktériumtestektől ülepítő centrifuga felhasználásával elkülönítjük. A centrufugálás során kapott felülúszó tartalmazza a pilusantigént és az kerül további felhasználásra a találmány szerinti vakcina a) jelű vagy pilusantigén komponenseként. A víruskomponens, vagy b) jelű összetevő előállításához a hasmenéses tünetek között megbetegedett borjakból általunk először izolált, H. C. S. jelű, a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében az NCAIM (P) 001099 szám alatt 1989.09.19-én letétbe helyezett vírustörzset használjuk fel. A vírustörzs sejttenyészetekben szaporítható és mind natívan, mind pedig haematoxilin eosin festéssel citopatogén elváltozásokat mutat, amelyek a sejtek megnyúlásában, kifliszerűvé zsugorodásában, a magok széttöredezésében és végül a sejtek fokozatos leválásában nyilványulnak meg. A H. C. S. vírustörzs immunfluoreszcenciás és vírusncutralizációs vizsgálatokban szoros antigénszerkezeti rokonságot mutat a Nebraska NCD vírustörzzsel. A vírusszaporításhoz szükséges törzsanyagot fagyasztva tárolt törzsből állítjuk elő, MA-104 jelű majomvese sejtvonalon való szaporítással [az MA-104 jelű majomvese sejtvonal ismertetése megtalálható: Arch. Exper. Vet. Med. 41, 908-13 (1987)]. Az így kapott tenyészetből leszüretelt vírusszuszpenziót etilén-iminnel inaktiváljuk, ellenőrizzük a sterilitását és ártalmatlanságát (citopatogén hatás vizsgálatával). Az oltóanyag előállítására csak az összetevők kedvezőeredményű sterilitási és ártalmatlansági vizsgálata után kerülhet sor. Az oltóanyag előállításához megfelelő arányban elegyítjük az a) jelű vagy pilusantigén komponenset a b) jelű, vagy vímskomponenssel. Előnyös elegyítési arányok térfogatban: a):b)=0,5-2,0 : 3,0-6,0 legelőnyösebb az 1:5 térfogatarány. Az elegyítés után olajos adjuvánst adunk hozzá, amelyet Span 80 (Atlas), Span 20 (Atlas), Tween 60 (Atlas) és Marcol 52 olaj (ESSO) összetevőkből állítunk össze. Az adjuváns hozzáadása után az oltóanyagot +4 °C hőmérsékleten tároljuk. Az oltóanyaggal a teheneket vemhességük utolsó harmadában 3 hetes időközzel kétszer kell oltani úgy, hogy a második oltást követően 2 hét teljen el az ellésig. Ha az utolsó oltás és az ellés között hosszabb idő telik el, akkor a teheneknek elléskor egy harmadik oltást célszerű adni. Javasolt az elléskori 3-ik oltás húsmarha állományok esetében is. Az újszülött boijak a föcstej (kolosztrum) itatásával válnak védetté. A virulens vírus semlegesítése közvetlenül a bélcsatomában történik, ezért fontos, hogy az első föcstejitatás az ellés után 1 órával megtörténjen. Az újszülött botját legalább 10-14 napon át, naponta 4-5 alkalommal ajánlatos itatni föcstejjel. Megfelelő számú ellés esetén kedvező lehet, ha a harmadik naptól a teljes tejet megfelelő higiéniás viszonyok között gyűjtött és egységesített elegy-föcstejjel dúsítják. Az oltóanyag egyszeri adagja 5 ml, izomba oltva. Az eljárással előállított oltóanyag hatásosságát nagyüzemi körülmények között vizsgáltuk. A vizsgálatok során oltatlan állományhoz, a monovalens víruskomponenssel oltott [b) jelű komponens] állományhoz és az E. coli okozta hasmenéses megbetegedés elleni Phylacol K99 néven (Phylaxia Oltóanyagtermelő Vál^. lalat, Magyarország) forgalomba hozott oltóanyaggal; kezelt állományhoz hasonlítottuk a találmány szerinti eljárással előállított oltóanyaggal kezelt állományt. A vizsgálatok statisztikailag összesített eredményeit a körvetkező táblázat tartalmazza. Született Elhullott Megbetegedett db % db % Oltatlan 99 25 25,2 86 86,8 Monovalens víruskomponens 112 16 14,2 74 66,0 Monovalens .Phylacol K99" 105 15 14,2 72 68,5 Találmány szerinti készítmény 104 6 5,7 24 23,0 A találmány szerinti eljárással előállított készítmény hatékonyságának vizsgálatai bizonyítják, hogy az újszülött borjak járványos hasmenéses megbetegedésének aránya közel negyedére, az elhullás aránya pedig közel ötödére csökkenthető a kezeletlen állományhoz viszonyítva. A monovalens készítményekkel kezelt állományokban ez az arány csak egyharmaddal csökkenthető, ugyancsak az oltatlan állományhoz viszonyítva. A találmány szerinti eljárást és oltóanyagot a következő példával mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kört arra korlátoznánk. Példa: Pilusantigén komponens előállítása [a) összetevő] Az oltóanyag a) összetevőjének előállításához ST+ K99 antigénszerkezetű E. coli törzset használunk fel, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
