203964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kötődés indukálására alkalmas gyógyszerkészítmény és hatóanyaga előállítására
1 HU 203 964 B 2 1. táblázat Fehérjék molekulatömeg szerinti megoszlása zománchártya-extraktumokban Extraktum jele Fehérjék becsült molekulatömege (kd) 5-12 6-14 10-15 16 22 24 67 • E-l XX XX XX XX XXX XX XXX E-3 XX XX XX XXX X E-4 XX XX XXX E-5 XX XX XXX X E-7 XX XX XXX E-8 XX XX XXX X x - nyomokban, xx- kis mennyiségben, xxx - nagy mennyiségben Az eredményeket 8 hét múlva értékeltük kvantitatív szövettani módszerekkel. A gyógyulási folyamat eredményét a kísérleti anyag hatására képződött cementum, fogmeder-csont és csonthártya mennyiségének az eredeti mennyiséghez viszonyított %-os arányában adjuk meg (2. táblázat). 2. táblázat A kísérleti készítmények hatására képződött cementum, fogmeder-csont és csonthártya aránya az eredeti mennyiséghez viszonyítva (gyógyulás foka, %) Készítmény: kontroll E-l E-2 E-3 E-4 E-5 E-6 E-7 E-8 E-9 Gyógyulás (%) 5 93 3 79 4 49 2 0 48 5 A táblázatból látható, hogy az alacsony molekulatömegű fehéije-frakciókat tartalmazó készítmények hatására a sérült szövetek regenerálódtak, míg a többi készítmény gyakorlatilag a kontrollal azonos hatású volt, a sérüléseket csak a szájnyálkahártya hámszövete fedte. A kísérlet eredményei arra utalnak, hogy a zománchártya-kivonat alacsony molekulatömegű fehérje-frakciója új kötődés kialakulását indukálja a fog és az állcsont között, ezért alkalmas a foggyökérhártya-gyulladás következményének kezelésére. 2. példa Sómentes savas kivonat készítése zománchártyából Az E-3 extraktum mintájára készült anyagot feloldjuk 0,1 mólos ecetsav-oldatban (144 mg-ot 12 ml-ben) és egy Sephadex G-25 SF töltetű oszlopra (15x540 mm) öntjük fel. A leoldást 0,1 mólos ecetsav-oldattal végezzük; az első fehérjedús frakciót elkülönítjük és liofilizáljuk. A kapott 34 mg termék 72% fehérjét tartalmaz, ami megfelel a kiindulási anyag összfehétjetartalma 85%-ának. A maradék fehérjét a sókat hordozó frakcióban találhatjuk, amelynek liofilizálás utáni tömege 63 mg, fehérje-tartalma pedig 7%. Az így kapott, liofilizált terméket 20 mg-os adagokra osztottuk és 10 ml-es fiolákban, besugárzással sterilezve (35 kGy) tároltuk a felhasználásig. A biológiai aktivitást az 1. példában leírt módon vizsgáltuk: a készítmény hatására a gyógyulás 72% volt, szemben a kontroll 4%-os értékével. 3. példa Tisztított fehérje-frakció előállítása 200 mg E-3 jelzésű extraktumot - a 2. példában is használt anyagból - feloldunk 20 ml 0,1 mólos ecetsav-oldatban és egy Sephadex G-75 töltetű oszlopra (25x780 mm) öntjük fel. A leoldást 4 °C hőmérsékleten, 0,1 mólos ecetsav-oldattal, 55 ml/óra átfolyással végezzük; az átfolyó oldat fehérjetartalmát Uvicord UV-fotométerrel folyamatosan mérjük. A fehérjét tartalmazó mintákat öt csoportban egyesítjük, majd SDS- poliakrüamid gélelektroforézissel vizsgáljuk a fehérjék molekulatömeg szerinti megoszlását. Az eredmények a következők: (1) frakció (50-60. minták): 40 kd-nal magasabb molekulatömegű fehérjék (enamelinek); (2) frakció: (62-80. minták): magas, kb. 25 kd molekulatömegű amelogeninek; r (3) frakció: (90-100. minták): közepes, kb. 14 kd molekulatömegű amelogeninek; (4) frakció: (110-125. minták): alacsony (5-10 kd)molekulatömegű amelogeninek; -j? (5) frakció: (130-160. minták): különböző sók. 1, A (2), (3) és (4) frakciókat liofilizálva rendre 10,?és 12 mg anyagot kapunk, amelyek fehérjetartalma SŰSh felett van. A három anyagot (magas, közepes és alacsony molekulatömegű amelogeninek) az 1. példában leírt módon vizsgálva az eredmény a következő^?.''’, táblázat). ^ 3. táblázat A kísérleti készítmények hatására képződött ^ cementum, fogmeder-csont és csonthártya aránya az . eredeti mennyiséghez viszonyítva (gyógyulás foka, %) Készítmény: kontroll magas közepes alacsony molekulatömegű amelogenin Gyógyulás (%) 3 78 21 15 Megállapítható tehát, hogy új kötődés jön létre a magas molekulatömegű amelogenin alkalmazása esetén és kisebb mértékben a köztes, illetőleg az alacsony molekulatömegű amelogenin alkalmazásakor. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy az amelogenin magas molekulatömegű frakciójának alkalmazása (amelyet a zománchártyából állítunk elő) igen hatékonyan segíti elő a szöveti rögzülést a periodontitis kezelésekor. 4. példa Savas kivonat készítése zománchártyából 6 hónapos, mintegy 80 kg vágótömegű süldők alsó állkapcsát leválasztjuk, kicsontozzuk, a csontot megtisztítjuk és még a vágóhídon lefagy asztjuk. A megfelelő fogbimbókat a fagyott csontból kimetsszük és a zománchártyát izoláljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
