203933. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyapot regenerálására sejttenyészetből
1 HU 203 933 B 2 mainak fényképe. A fénykép 44,4-szeres nagyítású. Az 1,1 cm-es vonalszakasz 0,25 mm-t képvisel. A4, ábra a (c) lépésben leírt eljárással termelt, finoman diszpergált pro-embrionális sejttömeg fényképe. A fénykép 44,4-szeres nagyítású. Az 1,1 cm-es vonalszakasz 0,25 mm-t képvisel. Az 5-8. ábrák globuláris, illetve szív-alakú, illetve torpedó-alakú, illetve érett embriók fényképe, amelyet a jelen találmány szerinti (d) lépésben állítottunk elő. A fénykép 2,7-szeres nagyítású. Az 1,8 cm-es vonalszakasz 0,5 mmt képvisel. Az alábbiakban részletesen ismertetők a találmányt Meglepő módon arra jöttünk rá, hogy olyan gyapot (Gossypium spp.) embriókat tudunk hatékonyan előállítani szomatikus embriogenezis segítségével, amelyek képesek a csírázásra és regenerálódásra; úgyjárunkel,hogy pro-embrionális sejttömeget és ezekből embriókat fejlesztünk ki sejtszuszpenziós tenyésztő rendszerben. A jelen eljárás lehetővé teszi mintegy 10 000 globuláris embrió termelését pl. standard, 250 ml-es DeLong lombikban; ezekből a globuláris embriókból mintegy 1000 érett embriót és mintegy 50 növényt kaphatunk. A technika állásában eddig ismert eljárások nem tettek lehetővé ilyen hatékonyságot A jelen találmány szerint előállított gyapot növények lehetnek tenyésztett vagy vad típusúak. A tenyésztett típusúak az előnyösek. A tenyésztett gyapotra példák lehetnek a Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum és Gossypium barbadense. A Gossypium hirsutum az előnyös. A G. hirsutum változatai közűi, amelyek képesek regenerálódni a jelen találmány eljárása szerint, találhatók a Coker 310, Coker 312, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Funk 519-2 és Funk 522-1. Az előnyös változat a Coker 310. (a) lépés. Embriogén gyapot kallusz A jelen találmány eljárásának első lépése gyapot kalluszképződés indukálása gyapot explantátum szövetből. A megfelelő gyapot explantátum szövetekre példák lehetnek a szomatikus embriók, érett és éretlen zigótás embriók, csíranövényekből származó sziklevelek vagy hipokotilok és érett csiranövényekből származó fiatal szövetek. Az előnyösek a szomatikus embriók és a csíranövény sziklevelek vagy hipokotilok. A zigótás embriókat pl. magkezdeményből vagy kimetszéssel kaphatjuk meg. A magkezdeményeket előnyösen 7-30 nappal vágjuk el a beporzás után, előnyösen 4-9 napos korban, és legelőnyösebben 7 napos korban. A hipokotilokat hosszirányban hasítjuk fel és megfelelő részekre vágjuk, pl. 1-20 mm közti méretre, előnyösen 2 mm méretre. A sziklevél szövetet 1-400 mm2 közti darabokra, előnyösen 5-100 mm2 közti darabokra, legelőnyösebben mintegy 10 mm2-es darabokra vágjuk. Az ebből a munkamenetből származó embriók a legelőnyösebb források ahhoz, hogy a jelen eljárás szerinti embriogén kalluszhoz jussunk. Szomatikus embriókat kaphatunk pl. az azokat a fentebb leírt módszereket alkalmazva, amelyek hipokotilhoz és sziklevél-szövethez, mint explantátum forráshoz használhatók. Bármilyen szomatikus embrió, amelyet a primer levél kiterjesztés előtt kivettek, alkalmas. A szomatikus embrió mérete nem kritikus. A szomatikus embrió előnyösen azonban kisebb, mint 5 mm hosszúságú. Egy érett növényből származó fiatal szövetet kényelmesen megkaphatunk olyan módon, hogy kimetsszük a hajtás csúcsának 10 cm-ét, előnyösen mintegy 5 cm-ét. A nyél- és szárszövetet hosszában felmetsszük és azonos mérető darabokra vágjuk, mint a hipokotiloknál tettük (lásd korábban). A levélszövetet azonos mérető darabokra vágjuk, mint a sziklevél szövetet (lásd korábban). A gyapot növényi szövetet megfelelő kalluszt indukáló tápközegre helyezzük 20-40 °C közti, előnyösen 23 °C és 35 °C közti, legelőnyösebben 31 °C hőmérsékletre. Bármely olyan tápközeget, amely képes kalluszt indukálni a szövetből, alkalmazhatunk a jelen találmány szerinti eljárásban. A tápközeg lehet folyékony vagy szilárd, bár a szilárd tápközeg előnyösebb azért, mert kényelmesebb. Az egyik tápközeg, amely képes kalluszt indukálni a találmány szerinti körülmények között, szervetlen sókat, vitaminokat, valamilyen szénforrást, valamilyen auxint és valamilyen citokinint tartalmaz. A tápközeg pH-ját 3,5 és 7,5, előnyösen 4,5 és 6,5 közé és legelőnyösebben 5,7-re állítjuk be. Bármilyen szervetlen só és vitamin, amely képes elősegíteni a kallusz-indukciót, alkalmas. Megfelelő szervetlen sókra és vitaminokra példák lehetnek azok, amelyeket Murashige és Skoog [Physiol. Plant 15, 473-497 (1962)] (MS), illetve Gamborg és munkatársai [Exp. Cell. Res. 50,151-158 (1968)] (B-5) írtak le. Egy másik példa az MS vagy Gamborg-féle B-5 tápközeg módosítása, amelyet Cheng és munkatársai írtak le [Plant Sei. Lett 19.91-99 (1980)]. Az előnyös szervetlen sók az MS szervetlen sók. Az előnyös vitaminok a. Gamborg-féle B-5 vitaminok. A szénforrás lehet bármilyen szénfonás, amelyen a kallusz növekedni tud. Az előnyös szénfonások között találjuk a cukrokat és cukor-származékokat. Az előnyös cukrok a glükóz és a szacharóz. Különösen kívánatos, hogy a kallusz beindítása olyan kallusz-indukciós tápközegben történjék, amely glükózt tartalmaz, abból a célból, hogy csökkentsük a szövet bámulását, majd a kalluszt átvisszük olyan kallusz-indukciós tápközegbe, amely szacharózt tartalmaz. A szénforrás koncentrációja 5-60 g/liter, előnyösen mintegy 30 g/liter. A kallusz-indukciós tápközegben levő auxin bármilyen olyan auxin lehet, amely képes kalluszt indukálni. A megfelelő auxinok között találjuk az a-nafdil-ecetsavat, picloramot, 2,4,5-triklór-fenoxi-ecetsavat, 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, indoI-3-vajsavat, indol-3-tejsavat. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
