203906. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a merszacidin nevű új antibiotikum és sói és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 906 B 2 Az így kapott, félig tiszta antibiotikumot lipofil gélszűrő anyagon, például Sephadex® LH-20-on kromatografálva tisztítjuk tovább, eluálószerként például vizet, metanolt, kloroformot, hexánt vagy ezek megfeleld kombinációját alkalmazva, és adott esetben utólagos aktív szenes kezelést is végzünk, vagy preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végezzük a tisztítást, szilikagél-oszlopon, eluálószerként például metanolt, acetonitrilt, vizet, vagy ezek megfeleld kombinációját alkalmazva. A tisztítást előnyösen oktadeciltriklór-szilán-csoportokat tartalmazó HPLC-anyaggal [például a Hypersil® (Shandon, USA)] töltött oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végezzük, acetonitril és víz 70:30 térfogatarányú elegyének alkalmazása mellett. A biológiailag aktív eluátumokból a szerves oldószert például vákuumban végzett desztillálással eltávolítjuk, majd a vizet liofilizálással távolítjuk el. A merszacidint fehér por formájában kapjuk. A merszacidin antibakteriális hatása következtében (lásd hatástani példák) gyógyászati készítmények hatóanyagaként használható. A találmány tárgya ennek megfelelően eljárás gyógyászati készítmények előállítására, amelyek a merszacidinen, mint hatóanyagon kívül a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozóanyagokat és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmazzák. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények antibiotikumként és/vagy immunszupresszív hatású szerként használhatók. A találmányt közelebbről az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni. 1. példa Y-85,54728 törzs izolálása talajból (a) Izolálásra használt tápközeg összetétele proteoz-pepton 20,0 g kálium-szulfát 1,5 g magnézium-szulfát-heptahidrát 1,5 g glicerin 10,0 g agar-por 15,0 g ionmentes víz 1 liter pH 6,8 (b) Talajelőkészítés és izolálás 10 g talajmintához - amelyet egy sóbepárlóból (Mulundból) nyertünk - 90 ml steril, ioncserélt vizet adunk 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban, és a lombikot körkörös rázógépen, 220 fordulat/perccel 2 órán keresztül rázatjuk. Az így kapott talajszuszpenziót sorozathígítással 1 (Mó dszeresére hígítjuk. Az utolsó hígítással kapott szuszpenzióból 1 ml-t 153,4 mm átmérőjű steril Petricsésze közepébe mérünk, hozzáöntünk kb. 50 ml fenti összetételű, 45 'C-ra lehűtött izoláló tápközeget, és a lemezt alaposan összerázzuk. A talajszuszpenzió és tápközeg elegyét hagyjuk megszilárdulni és 3 napon keresztül 28±1 "C-on inkubáljuk. A Petri-csészéket szabályos időközökben kiértékeljük és a szaporodó mikroorganizmusok közül az Y-85,54728 törzset izoláljuk. 2. példa Y-85J4728 törzs fenntartása (a) Fenntartásra használt agaros tápközeg összetétele pepton 10 g marhahúskivonat 3 g élesztőkivonat 3 g agar-por 15 g ionmentes víz 1 liter pH 12 (b) Tenyészet fenntartása Az (a) pontban megadott komponenseket a vízben melegítés közben feloldjuk, majd kémcsövekbe szétosztjuk és 121 °C-on 20 percen keresztül sterilizáljuk. A kémcsöveket ferde helyzetben hagyjuk lehűlni, így ferde szilárd tápközeget kapunk. A ferde agart drótkacs segítségével beoltjuk az Y-85,54728 törzzsel, és 28±1 *C-on jól látható szaporodás eléréséig inkubáljuk. Az így nyert tenyészetet 8 ‘C-on hűtőszekrényben tároljuk. 3. példa Y-85,54728 törzs fermentálása rázott lombikban (a) Oltótenyészet tápközegének összetétele kazein-hidrolizátum 5 g kukoricalekvár 5 g glicerin 20 g galaktóz 10 g ionmentes víz 1 liter pH 12 (b) Oltótenyészet készítése A fenti összetételű tápközeget 250 ml-es Erlenmeyerlombikokba osztjuk szét 25 ml-enként és 121 *C-on 20 percen keresztül autoklávban sterilizáljuk. A lombikokat lehűtjük és a 2. példa (b) lépése szerint kapott tenyészetből 1 kacsnyi baktériummal beoltjuk, majd 28±1 °C-on 24 órán keresztül 220 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. A kapott tenyészetet használjuk a fermentáló lombikok beoltására, az alábbiak szerint. (c) Merszacidin antibiotikum előállítása rázott lombikban A fermentálásra használt tápkőzeg összetétele a 3. példa (a) pontjában megadott. A tápközeget 100 ml-enként 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba méljük, és 121 *C-on 20 percen keresztül autoklávozzuk. A lombikokat lehűtjük, majd 1 térfogat%-nyi 3. példa (b) pontja szerint előállított oltótenyészettel beoltjuk. A fermentálást körkörös rázógépen 220 fordulat/perc sebesség mellett 28±1 °C-on 66 órán keresztül folytatjuk. Az antibiotikum képződését agarlemez-diffuziós módszerrel ellenőrizzük, a biológiai aktivitást Staphylococcus aureus 209 P, Staphylococcus aureus R 85 és Alcaligenes faecalis törzs alkalmazásával mérjük. A fermentálás leállítása után a tenyészetet centrifugáljuk és a merszacidint a tenyészet felülúszójából az alábbiak szerint izoláljuk és tisztítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
