203873. lajstromszámú szabadalom • Eljárás helyettesített alkánkarbonsavamidok és származékaik és az e vagyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 873 B 2 keszámlálást Royco Cell-Crit 921 felhasználásával végezzükel. PAF által előidézett hörgösszehúzódás meghatározása Hím tengerimalacokat (Hartley törzs, 400-500 g) metánnal [2 g/kg, i.p.] érzéstelenítünk. Minden állat tracheáját kanüfezzük és a tengeri malacokat Harvard-féle kis rágcsáló lélegeztető segítségével lélegeztetjük (3,0 ml-es lökettérfogat, percenként 40 légzés). A tracheális nyomást a tracheába illesztett és Statham nyomás transducerrel összekapcsolt kanülből feljegyezzük. A juguláris vénát a teszt-vegyület beadagolásához kanülezzük. A spontán légzést vérlemezke aktiváló faktor (PAF) intravénás befecskendezése előtt 2 perccel beadott szukcinil-kolinnal [1,2 mg/kg, i.v.] leállítjuk. Minthogy a propranollal a hörgösszehúzódási reagálásokat fokozza, a kihívás (challenge) előtt 5 perccel az összes állatot propranollal [0,1 mg/kg, i.v.] kezeljük. Az intravénás teszthez a tengerimalacokat propranolol 0,1 mg/kg i.v. dózisával 5 percen át előkezeljük. A teszt-vegyületet a PAF-al i.v. előidézett kihívás (challenge) előtt 1 perccel adagoljuk. Ezután az állatba 0,1 |ig/kg i.v. dózisban PAF-t fecskendezünk és mérjük a tracheális nyomás változását. Az orális teszt során a teszt-vegyületet 2 órával a AF befecskendezése előtt orális csövön keresztül adagoljuk. A propranololt vagy szukcinil-kolint és a PAF- t intravénásán fecskendezzük az állatokba és méijük a tracheális nyomás változását. A tracheális nyomás változását oly módon határozzuk meg, hogy a szukcinil-kolin beadása után kapott állandó alapvonalat levonjuk a PAF beadása után kapott hörgösszehúzódási csúcsból. Az átlagértéket minden állatra kiszámítjuk és a hörgösszehúzódás százalékos gátlását a kontroll állatok átlagértékeivel való összehasonlítással kapjuk. A standard hibát az átlag standard hibájaként számítjuk. Az (I) általános képletű vegyületek tromboxán szintáz (TXA2Syn.) gátló hatással is rendelkeznek, amelyet az alábbi teszttel igazolunk. TXA 2 szintetáz gátlása A tromboxán szintetáz (TXA2 szint) gátló aktivitást oly módon határozzuk meg, hogy nyomonkövetjük a ,4C-tromboxán A2 (TXA^ átalakulását, enzimforrásként humán vérlemezkékből nyert mikroszómás frakciók felhasználásával. A vizes inkubációs közegben a TXA2 gyorsan TXB2-vé alakul. A TXA2 szin. mennyiségét olyan értékre állítjuk be, hogy a meghatározás körülményei között a kontrollcsövekben a PGH2 szubsztrátum kb. 80-90%-a alakuljon át termékké. A14C-PGH2 elkészítéséhez 14C-AA-t (50-60 mCi/millimól) bárány ondó vezikuláris mirigy mikroszómákkal másfél percen át 37 ’C-on inkubálunk, majd a 14C-PGH2-t dietil-éterrel extraháljuk, Sephadex LH-20 vagy kovasav sozlopon tisztítjuk és acetonban -70 *C-on tároljuk. Az inkubálásokat a következőképpen végezzük el: az inkubációs csövekhez 10 pmól (kb. 30.000 cpm) végső koncentrációt biztosító mennyiségben 14C-PGH2-t adunk, majd az acetont nitrogén alatt eltávolítjuk. A csöveket jégfürdőbe helyezzük, majd 215 p.1 jéghideg foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldatot, 10 p.1 etanolt (kontroll) vagy a teszt-vegyület etanolos oldatát és 25 p.1 mikroszómás szuszpenziót adunk hozzá, keverés közben, a lehető leggyorsabban. A csöveket 22 °C-on 2 percen át inkubáljuk, majd a reakciót leállítjuk, a radioaktív termékeket és az átalakulatlan PGH2-t extraháljuk és vékonyrétegkromatográfiásan megelemezzük. A termékekké alakult 14C-PGH2 mennyiségét vékonyrétegkromatográfiás úton meghatározzuk. A TXA2 szintetáz aktivitás mértékeként a termékekké alakult 14CPGH2 mennyiségét használjuk fel. Az inhibitorokat kezdetben 100 pmól koncentrációban alkalmazzuk. Az IC50 értékeket a teszt-vegyület egymásutánkövetkező tízszeres hígításainak lineáris regressziós analízisével számítjuk ki. Az (I) általános képletű vegyületeknek a fenti tesztek során mutatott hatékonysági adatait az I. és II. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 I. táblázat Teszt-vegyület PAF kötődés gátlása IC50 (nmól) PAF által előidézett hörgösszehúzódás gátlása 1 mg/kg (iv.) [R-(E)] -3-( 1 -butil-6-metoxi-2-naftalenil)-N-[ 1 -metil-4-(3-piridinil)-butil]-2-propénamid 7 95± 1% [R-(E)]-3-(l-butil-3,4-dihidro-6-metoxi-2-naftalenil)-N-[l-meül-4-(3-piridinil)-butil]-2-propénamid 90 94± 2% [R-(E)]-3-[6-metoxi-l-(4-metoxi-fenil)-2-naftalenil]-N-[l-metil-4-(3-piridiniI)-butil]-2-propénamid 30 95+ 2% [R-(E)]-3-[3,4-dihidro-6-metoxi-1 -(4-metoxi-fenil)-2-naftalenil)-N- [ 1 -metil-4-(3-piridinil)-butil]-2-propénamid 55 92± 3% 11
