203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 lehetnek pl. egészen 20 000-ig, bár ilyen nagyméretű hibridizációs próbával dolgozva, általában romlik az érzékenység. Ezek a szegélyezőszekvenciák még akkor is tartalmazhatnak kettős szálú DNS-t amikor az ismétlődő szekvenciák egyes szálú DNS-ből állnak. Az azonosítási módszer bármely ismert hibridizációs technikán alapulhat, legáltalánosabban a DNS-mintát olyan restrikciós enzim(ek)kel emésztjük, (egy, vagy több enzimmel, az igények szerint), melyek nem hasítanak bele a tandemismétlődő szekvenciákba, vagy csak olyan kis mértékben hasítják azokat, ami a hibridizációs vizsgálat hatékonyságát nem rontja. A találmány tárgyát az alábbi példák szemléltetik, anélkül, hogy igényünket ezekre korlátoznánk. A hőmérséklet mindenütt ‘C-ban van megadva. I. példa (1) A humán mioglobingénből származó, hosszú tandemismétlődő szekvenciákat tartalmazó hibridizációs próba előállítása Az 1. ábra sematikus ábrázolásban, öt lépésben mutatja be a fenti hibridizációs próba előállítását, az egyes lépéseket (a), (b), (c), (d), (e)-vel jelölve. A kiindulásnál felhasznált mioglombingén (a) leírása P. Weller és mtsai cikkében található (EMBO J. 3, 439-446,1984). Ahogy az az említett cikkből kitűnik, a gén első intronjában található egy olyan régió, amely egy 33 bázispáros szekvencia négyszeres ismétlődését tartalmazza, s az ismétlődő egységen belül található 9 bázispáros szegélyezőszekvencia is csaknem pontosan ismétlődik (I. ábra). Ezt a génszakaszt egy 169 bázispáros HinfI fragmentumon izoláltuk, majd sokszorozás céljából, végfeltöltés után, a pUC13-as plazmid Smal helyére klónoztuk, lásd J. Vieira és mtsai. (Gene 19, 259-268, 1982). A harmadik és negyedik ismétlődő egységben történő Avail (A) hasítás után izoláltuk a monomer ismétlődő egységet (c). [Az 1-es és 2-es ismétlődő egységben 1-1 bázispár kicserélésével megszüntettük az Avail hasítási helyeket, és helyettük Ddel (D) helyeket alakítottunk ki.] Mivel az izolált fragmentum két végén keletkezett Avail ragadós végek egymástól különböznek, a monomer fragmentum ligációjával „fejláb’’ illeszkedésű, ismeretlen (n) számú ismétlődő egységet tartalmazó polimert (d) tudtunk előállítani. Azokat a polimereket, melyek legalább 10 ismédlődő egységet tartalmaztak, preparatív agaróz gélelektroforézis útján izoláltuk, majd végfeltöltés után a pUC13 plazmid Smal helyére ligáltuk, és E.coli JM83-ban klónoztuk, lásd J. Vieire és mtsai fent idézett cikkét. A leírt módon nyert pAV33.7 (e) plazmid polimer inszertjének szerkezetét a következő módon határoztuk meg: az inszertumot BamHI-EcoRI kettős emésztéssel kivágtuk a plazmid polilinkeréből, az így nyert fragmentumot a-3JP-dCTP segítségével rádioaktívan megjelöltük, a BamHI helyen történő feltöltéses jelöléssel, majd Avail enzimmel részlegesen megemésztettük. A végjelölt, részlegesen emésztett fragmentumokat egymástól 2%os agaiózgélen történő gélelektroforézis segítségével választottuk el. Azt találtuk, hogy a pAV33.7 jeli plazmid, a 767 bázispár-hosszúságú BamHI-EcoRI fragmentumán (c) a 33 bázispáros monomer egység 23- szoros ismétlődését tartalmazta, ahogy az ábra is mutatja. (2) A humán genomból, a 33 bázispáros mioglobinismétlődést tartalmazó hibridizációs próbával azonosított miniszatellit-régiók szekvenciaanalízise. Egy X47.1 fágban klónozott, 10-20 kilobázisos fragmentumokat tartalmazó humán génkönyvtárat (lásd P. Weller és mtsai idézett cikkét, valamint W. A. M. Loenen és mtsai Gene 20,249-259,1980) teszteltünk a pAV33.7 plazmid 767 bázispáros inszertjéből készített próbával [lásd (1) lépés, fent] történő hibridizáció útján, a próbákat 32P izotóppal jelöltük, P. Weller és mtsai módszere segítségével (idézet: lásd fent). Nyolc pozitív plakkot izoláltunk, és 33.1-15 jellel láttunk el. Minden plakkból DNS-t izoláltunk, majd a mintákat külön-külőn Hinfl-gyel, vagy HaelH-mal emésztettük, majd 1,5% agarózgélben elektroforetizáltuk. Ezután a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődésével homológ szekvenciákat Southern blott hibridizációval azonosítottuk, a pAV33.7-ből származó próba segítségével. Mindegyik rekombináns fág DNS egyetlen „A33-pozitív” fragmentumot tartalmazott, mind Hinfl-gyel, mind pedig Haeül-mal történő emésztés után, kivéve a >33.4 és X33.ll jelű fág DNS-eket, amelyekben nem volt azonosítható HaelII fragmentum (ez annak köszönhető, hogy ezen rekombináns fágokban található ismétlődő régiókban volt Haeül hasítóhely). A X33-pozitív HinfI és Haeül fragmentumokat preparatív gélelektro-^ forézis segítségével izoláltuk, szükség esetén feltöltés?f5 sei tompa végeket alakítottunk ki, majd a kettős szálú, M13mp8 DNS (J. Messing és mtsai, Gene 19, 269-r. 276, 1982) Smal helyére ligáltuk. Pozitív egyes szálú M13 rekombinánsokat izoláltunk E.coli JM101-be történő transzformáció után, majd ezeket a dideoxinukleotidos láncterminációs módszer segítségével szekvenáltuk. Mindegyik X33-pozitív fragment tartalmazott tandemismétlődő régiót, melyet néhány esetben közvetlenül meg lehetett szekvenálni. A többi esetben, amikor az ismétlődő régió túl messzire volt a szekvenáló primertől, az M13 inszerteket restrikciós hasítással megrövidítettük, majd újra szekvenáltuk. A X33-pozitív fragmentumok szerkezetét az alábbiakban nyolc térkép segítségével fogjuk bemutatni, melyeket X33.1, X33.3, X33.4, X33.5, X33.6, X33.10, X33.ll és X33.15 jelekkel láttunk el. A bemutatott fragmentumok hosszát (nukleotidban) és a használt restrikciós enzimeket a következőkben adjuk még: X33.1: Halü, 2000; X33.3: HinfI, 465; X33.4: HinfI, 2000; X33.5: HinfI, 1600; X33.6: Haeül, 720; X33.10: Haeül, 720; X33.ll: HinfI, 1020; X33.15: HinfI, 1220. Minden térkép megad egy ismétlődő nukleotidszekvenciát, nagybetűvel egy téglalap alakú keret fölé írva. Az „ismétlődések” nem teljesen azonosak egymással, sem a nukleotidok számát, sem a bázisok minőségét tekintve. Éppen ezért a megadott ismétlődő szekvencia mindig egy olyan konszenzus-(con)-szekvencia, mellyel az elvégzett szekvenciaanalízisek eredménye a lehető legnagyobb összhangban van. A kereten belül azt láthatjuk, hogy az ismétlődések miben térnek el a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
