203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 esetében a DNS-analízis gyors zigoticitás-meghatározást tett lehetővé. A DNS-hibridizációs próbák tehát - a találmányban leírtaknak megfelelően - egy olyan egyszeri genetikai vizsgálatot tesznek lehetővé, ami minden többgyerekes terhesség esetén biztosítja a zigotici- 5 tás meghatározását. 18. példa A 33.6 és 33.15 egyszálú DNS-próbákat használtuk 12 újszülött ikerpár zigoticitásának meghatározására. A kapott eredmények a 6. táblázatban láthatók. 6. táblázat Eset Gesztációs kor Nem Placenta* DNS-mintázat 1. 38 hét NN 1 chorion megegyező 2. 38 hét FN 2 chorion nem egyező 3. 30 hét FF 2 chorion megegyező 4. 33 hét NN 1 chorion megegyező 5. 40 hét NN 2 chorion nem egyező 6. 37 hét FN 2 chorion nem egyező 7. 32 hét NN 2 chorion megegyező 8. 34 hét FN 2 chorion nem egyező 9. 39 hét FF 2 chorion nem egyező 10. 38 hét FN 2 chorion nem egyező 11. 27 hét FF 2 chorion megegyező 12. 35 hét NF 2 chorion nem egyező * mindegyik placenta diamnális A DNS-extrakciőhoz születéskor vett köldökzsinórvért, vagy a születés utáni napon nyert vénás vérmintát (0,5-1,0 ml) használtunk minden csecsemőesetében. A placentákat megvizsgáltuk, hogy egy vagy két amnionnal, illetve chorionnal rendelkeznek-e. A DNS-t standard módszerrel nyertük (Old, J. M., Higgs, D. R. Gene analysis. In: D. J. Weatherall, ed. The Thalassaemias. Method in Haematology, Churchill Livingstone, 1983), és 10-15 pg-nyi mennyiséget HinfI enzimmel emésztettünk. A mintákat 22 cm hosszú 0,6%-os agarózgélben, 45 V feszültséggel, kb. 36 óráig elektroforetizáltuk, amíg minden 1,5 kilobázis hosszúságúnál rövidebb fragmentum ki nem futott a gélből. A DNS-t blott eljárással átvittük nitrocellulóz filterre, majd 80 *C-on vákuumban 2 óráig inkubáltuk. Az egyszálú 33.6 és 33.15 próbákat 32P-vel megjelöltük, amint azt a korábbiakban ismertettük. Az eredményeket a 13. ábra mutatja be. A 13. ábrán az 1. és 2. sor az 1. esetszámú ikrekből nyert DNS- sávmintázatot mutatja, melyet a 33.6 egyszálú miniszatellit-próba felhasználásával kaptunk. A 3-19. sorok az egyszálú 33.15 próbával nyert ujjlenyomatokat mutatják be: 1. eset: 3-4. sáv; 2. eset 5-6. sáv; 3. eset 7-8. sáv; 4. eset: 9-10. sáv; 5. eset 11-12. sáv; 6. eset 13-14. sáv; 7. eset 15-16. sáv. A17-19. sávok hármasikreknek felelnek meg, lány, fiú, lány sorrend szerint. Az 1. és 2. sor a 3. és 4. sorral összevetve azt mutatja, hogy a két próba - a 33.6 és a 33.15 - különböző miniszatallit-csíkmintázatot detektál A méretmarkerek nagysága kilobázisban van megadva. Hét esetben (lásd 6. táblázat) a zigoticitás meghatározható volt egyszerűen az ikrek neme és a magzatburok vizsgálata alapján. Mindegyik egy chorionnal (vagy egy amnionnal) rendelkező iker (pl. 1. eset) egypetéjű, habár az egypetéjű ikreknek mindössze kb. 30 50%-a egychorionos placentájú (2). Emiatt az 1. eset ikreinek egypetéjűeknek kell lenniük, és náluk valóban egyező DNS-mintákat találtunk mind a 33.15, mind a 33.6 próbával (lásd 1. ábra). Öt esetben az ikrek különneműek voltak, és sávmintájuk különbözőnek is mutat- 35 kozott mind a 33.15, mind a 33.6 próbával vizsgálva. A 3., 5., 7., 9. és 11. esetben az ikrek azonos neműek voltak, és két chorionnal rendelkeztek, így ezek lehettek egy-, illetve kétpetéjűek is. A DNS-analízis azt mutatta, hogy két ikerpár (5. és 9. eset) különböző 40 csíkmintázattal rendelkezett, tehát kétpetéjűek voltak, míg a többi három esetben (3., 7. és 11. eset) a megegyező csíkmintázat egypetéjűségre utalt Két újszülött hármasiker esetét vizsgáltuk hasonló módon. Mindkét esetben az anya fertilitást elősegítő 45 gyógyszereket szedett a terhesség indukálására, és mindegyik gyereknek egyedülálló csíkmintázata volt (pl.: 13. ábra 17-19. sor). Az eredmények a 14. ábrán láthatók. Az 1. és 2. sáv az egyszálú 33.15 próbával nyert eredményeket, a 3. és 50 4. sáv a kettős szálú 33.15 próbával nyert eredményeket mutatja be. 19. példa Bár mind az egyszálú, mind a kettős szálú próba 55 megfelelő volt bármelyik diagnózis felállításához, de a radioaktív egyszálú próbákkal több csík volt megkülönböztethető (lásd 14. ábra). Az egyszálú próbák melletti alternatívaként tanul- 1 mányoztuk a megfelelő kettős szálú próbák használatá- 60 nak lehetőségét, amely módszer használatosabb a kü-26
