203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 5. példa Ez a példa a DNS-ujjlenyomatok szomatikus stabilitását mutatja be, valamint azok hasznosíthatóságát apasági vizsgálatokban. Egy EB vírussal transzformált limfoblasztoid sejtvonalat 2 évig folyékony nitrogénban tároltunk, majd folyadékkultúrában, ismét tenyészteni kezdtük. A tenyésztett limfocitákat kétszer megmostuk fiziológiás sóoldatban, majd a limfocita-üledékból, valamint fehérvérsejtekből DNS-t izoláltunk A. J. Jeffreys módszere alapján (Cell 18, 1-10, 1979). Hasonlóképpen izoláltunk DNS-t spermiumból is, azzal a különbséggel, hogy az ondófolyadékból összegyűjtött spermiumokat az SDS-es lízis elótt, 5 percig, 1 M 2-merkaptoetanollal, szobahőmérsékleten előkezeltük. A DNS- ujjlenyomatokat a 3. példában leírtak szerint állítottuk elő, a DNS-minták 5-5 pg-ját Hinfl-gyel emészve, és a 33.6 (a), valamint a 33.15 (b) hibridizációs próbákat használva. 6. példa Ez a példa a találmány tárgyát képező egyik hibridizációs próba hasznosíthatóságát mutatja be, különböző gerincesektől származó DNS-minták erősen polimorfikus régióinak kimutatására. DNS-mintákat készítettünk csirkék, verebek és vércsék véréből, nyúl- és egérmájból, emberi placentából, valamint békák és halak teteméből. A DNS-minták 8-8 pg-ját Hinfl enzimmel emésztettük, kivéve a csirke- DNS-mintákat, melyeket HaelH emésztésnek vetettünk alá. A restrickiósan emésztett DNS-mintákat 0,6%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, denaturáltuk, átvittük Sartorius nitrocellulóz filterre és hibridizáltuk, ahogy azt korábban az emberi eredetű 33.15 jelű hibridizációs próbával kapcsolatban már leírtuk. A hibridizációs körülmények a következők voltak: 65 “C, 1*SSC. A kísérlet eredményét az 5. ábra mutatja be, ahol a következő mintákat láthatjuk: I, 2: nem rokon emberi placenták 3: nyúl-DNS, az Alaszkai és Bécsi Fehér törzsek F, hibridjétől 4: nyúl-DNS, az alaszkai törzsből 5,6: egér (Mus musculus) DNS: két vadon fogott görög egértől 7: egér (Mus musculus) DNS: a DBA-2 jelű beltenyésztett törzsből 8: egér (Mus musculus) DNS: a C57/BL10 jelű beltenyésztett törzsből 9,10: csirke-DNS, megj.: a DNS-t Haelü-mal emésztettük II, 12: veréb-DNS 13,14,15: vércse-DNS 16,17: béka (Xenopus tropicalis) DNS 18,19: fürge cselle (hal) DNS. Az ábrán látható, hogy csaknem minden vizsgált gerincesről sikeres, változatos DNS-ujjlenyomatot lehetett készíteni, melyek ránézésre az emberi DNS-ujjlenyomatokhoz hasonlóan informatívak. A Hinfl-gyel emésztett csirke-DNS-rŐl készített DNS-ujjlenyomatban megjelent egy rendkívül összetett, kenődött (bár kevéssé intenzív) hibridizáló háttér (az ábrán nincs bemutatva), ami azonban HaelII emésztéssel megszüntethető volt, s így előtűnt a tiszta, polimorfikus ujjlenyomat-mintázat. A két beltenyésztett egértörzs DNS-ujjlenyomata kevésbé összetett, mint a vadon fogott egereké. Ez várható is volt, mivel a vadon élő egerek esetében a legtöbb hipervariábilis miniszatellit-lókusz feltehetően heterozigóta, míg a beltenyésztés során ezek homozigótákká válnak, s emiatt a beltenyésztett törzsek DNS- ujjlenyomalában a különböző hibridizáló fragmentumok száma a felére csökken. A következő példák tovább szemléltetik az egyes fent említett hibridizációs próbák hasznosíthatóságát. 7. példa Ez a példa a DNS-ujjlenyomatvizsgálat hasznosíthatóságát egy bevándorlási ügy kapcsán szemlélteti, melynek megoldása a hagyományos genetikai módszerekkel rendkívül nehéz, vagy teljesen lehetetlen lett volna. A szóban forgó ügy egy olyan ghánai fiú esete, aki Nagy- Britanniában született, kivándorolt Ghánába, édesapjához, majd egyedül visszatért Nagy-Britanniában, hogy édesanyjával és három testvérével éljen együtt Mindazáltal olyan bizonyítékok merültek fel,, melyek arra utaltak, hogy a visszatért fiú nem azonos azzal, aki kivándorolt, hanem vagy az anya vagy vala- * melyik leánytestvérének (akik mind Ghánában élnek) a ~ . fia, vagy pedig nem is rokon. Emiatt a visszatért fiú.:; nem kapta meg a letelepedési engedélyt Nagy-Britanniában. A család ügyvédjének kérésére DNS-ujjlenyomatvizsgálatot hajtottunk végre a fiú anyasági kérdésének tisztázására. Az ügyet tovább bonyolította, hogy sem az apa, sem az anya leánytestvérei nem voltak elérhetőek vizsgálat céljából. Ezenfelül: az anya biztos volt abban, hogy a fiú az ő gyermeke, de hogy ki a gyermek apja, afelől kétségei voltak. Ezért a család elérhető tagjainak (anya: M, fiútestvér B, leánytestvérek: SÍ és S2, és a vitatott fiú: X) véréből izolált DNS-mintákból Southern blott hibridzációjával DNS- ujjlenyomatokat készítettünk a fent leírt 33.6 és 33.15 jelű hibridizációs próbák segítségével, melyek mindegyike különböző hipervariábilis miniszatellit-mintázatot ismer fel az emberi DNS-ben. Az anya (M), a vitatott fiú (X), fiútestvére (B), leány testvérei (SI, S2) és egy nem rokon személy (U) véréből izolált DNS-minták 8-8 pg-ját Hinfl emésztésnek vetettük alá, 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, majd próbákkal Southern blott hibridizációnak vetettük alá. A készített autoradiogrammokat a 6. ábrán mutatjuk be. Az utódok DNS-ujjlenyomataiban az anya ujjlenyomataiban (M) is előforduló fragmentumokat rövid vízszintes vonallal jelöltük, míg az apai fragmentumokat, amelyek M-ből hiányoztak legalább egy vitán felül állűutód ujjlenyomatában (B, SI, S2) megtalálhatóak voltak, hosszabb vonallal jelöltük. Az X ujjlenyomataiban is megjelenő „anyai” és apai fragmentumokat ponttal jelöltük. X DNS-ujjlenyomatai ezeken a fragmentumokon kívül egyetlen azonosítható fragmentu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
