203792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás optikailag aktív 2-fenil-propionsavak mikrobiológiai előállítására
1 HU 203 792 B 2 elegye! 23 ml acetonitril és 1 n hidrogén-klorid- oldat 90:10 térfogatarányú elegyével hígítjuk. A baktériumokat centrifugálissal eltávolítjuk. A felülúszó nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végzett analízise szerint 46 pmól (S)(+)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsavat és 59 pmól racém és (R)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot tartalmaz. Nátrium-kloridot adunk hozzá, hogy a szerves és a vizes fázis elkülönülését elősegítsük. A szerves fázis bepárlása után a kapott maradékot 20 ml kloroform és 0,1 n nátrium-hidroxid-oldat 1:1 térfogatarányú elegyével felvesszük. A bázisos fázist lúgossá tesszük, ezt követően kloroformmal extraháljuk. A ketoprofén (R)(+)-a-metil-benzil-aminnal végzett származékképzése után végzett nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis szerint a két diasztereomer keverékben a (S)(+)-2-(3-benzoilfenilj-propionsav enantiomer-tartalma (optikai tisztaság) 93%. [d]i?-+42* (c-0,01, etanolban). 5. példa A 2. a) példa eljárása szerint előállított 180 mg (szárazanyagban kifejezve) Corynebacterium N 771 sejttel és 2 ml (50 mM) kálium-foszfát-puffer-oldattal, amelynek pH-ja 7, szuszpenziót készítünk. 25,3 mg (100 pmól) racém 2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot adunk. 48 órán keresztül keverjük 25 ‘C-on, ezt követően 23 ml acetonitril és 1 n hidrogén-klorid-oldat 90:10 térfogatarányú elegyét adjuk. A baktériumokat centrifugálissal távolítjuk el. A felülúszó nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végzett analízise szerint 76,03 pmól racém és (R)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot és 24,7 pmól (S)(+)-(3-benzoil-fenil)-propionsavat tartalmaz. Néhány mg nátrium-kloridot adunk hozzá, a szerves és a vizes fázist elkülönítjük. A szerves fázis bepárlása után kapott maradékot 20 ml kloroform és 0,1 n nátrium-hidroxid-oldat 1:1 térfogatarányú elegyével felvesszük. A vizes fázist savassá tesszük, majd kloroformmal extraháljuk. A ketoprofén és a (R)(+)-a-metilbenzil-aminnal végzett származékképzése után a nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis szerint a két diasztereoizomer keverékben az (S)(+)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav enantiomer-tartalom (optikai tisztaság) 94%. 6 6. példa Az 1. a) példa szerint előállított 24 mg (szárazanyagra számítva) Brevibacterium R 312 sejttel és 2 ml (50 mM) kálium-foszfát-puffer-oldattal, melynek pH- ja 7, szuszpenziót készítünk. 23,5 mg (100 pmól) racém 2-(3-benzoil-fenil)-propionitrilt adunk hozzá. 65 órán keresztül 25 ‘C-on keverjük, majd 23 ml acetonitril és 1 n hidrogén-klorid-oldat 90.10 térfogatarányú elegyét adjuk. A baktériumokat centrifugálással távolítjuk el. A felülúszót nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással analizáljuk, és 2,2 pmól racém és (R)-2-(3-benzoil-fenil)-propionitrilt, 53 pmól (R)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot és 44,7 pmól (S)(+)-2-(3-benzoü-fenil)-propionsavat tartalmaz. Néhány mg nátrium-kloridot adunk hozzá. A vizes és a szerves fázist elkülönítjük. A szerves fázis bepárlása után a kapott maradékot 20 ml kloroform és 0,1 n nátrium-hidroxi-oldat 1:1 térfogatarányú elegyével felvesszük. Dekantálás után a szerves fázist szárazra bepároljuk. A kapott maradékot (13,5 mg), amely a ketoprofén-amidot tartalmazza, 2 ml kloroformmal hígítjuk. Az oldat fotgatóképességének meghatározása szerint (R)(-)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amid enantiomer-tartalom 84%. A vizes-bázisos fázist savassá tesszük, majd kloroformmal extraháljuk. Az (S)(+)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav (R)(+)-cc-metil-benzil-amiddal végzett származékképzése után az elvégzett nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis szerint a két diasztereomer keverékében az (S)(+)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav enantiomer-tartalom (optikai tisztaság) 96%. 7. példa A 2. a) példában a Corynebacterium N 771 előállítása során ismertetett módszerrel Corynebacterium N 774-et (FERM P-4446) tenyésztünk. 176 mg (szárazanyagban kifejezve) sejtet tartalmazó fiolában 2 ml (50 mM) kálium-foszfát-puffer-oldattal, amelynek pH-ja 7, szuszpenziót készítünk, és 253 mg (100 pmól) racém 2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot adunk hozzá. 48 órán keresztül 25 ‘C-on keverjük, majd a reakcióelegyet az 1. példa szerinti eljárással kezeljük. A reakcióelegy analízise szerint 78,6 pmól racém és (R)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot és 22,4 pmól (S)(+)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsavat tartalmaz. Az (S)(+)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav enantiomer-tartalom (optikai tisztasága) származékképzés elvégzése uátn meghatározva 95%. 8. példa 5 ml-es autoklávba, amely 1 ml 28%-os (tömeg/térfogat) ammónium-hidroxidot tartalmaz, 20 mg (79 pmól) tiszta, (R)-2-(3-benzoil-fenil)-propionsav-amidot vezetünk be. Az autokláv lezárása után 2 órán keresztül 150‘C-on tartjuk. Lehűtés után az autokláv tartalmát 5 ml vízbe öntjük. A pH-ját 1 n hidrogén-klorid-oldat hozzáadásával 1-re állítjuk be. A vizes fázist kloroformmal extraháljuk. A kloroformos fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk. Szűrés után a térfogatát 2 ml-re töményítjük be. A kloroformos oldat optikai forgatóképessége 0. Az oldat nagynyomású folyadékkromatográfiás analízise szerint az oldat 72,2 pmól 2-(3-benzoil-fenil)propionsav-amidot és 4,1 pmól 2-(3-benzoil-fenil)-propionsavat tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
