203785. lajstromszámú szabadalom • Biokémiai eljárás Micromonospora fajok transzformálására, és az alkalmas plazmidvektorok előállítására
1 HU 203 785 B 2 plazmid PstI restrikciós enzimmel linearizált DNS- ével. Az így kapott plazmidvektorokkal E. coli K12 HB101 sejteket transzformáltunk és az Amp® telepekből hibridizációval választottuk ki azokat, amelyek tartalmazták a pSGE5 plazmidvektort. A pSGE5 plazmidhoz hasonló E. coli-Streptomyces- Micromonospora ingázó vektorokat a szakember más restrickós enzimekkel, illetve a fragmentumokat más kapcsolódási sorrendben vagy orientációban tartalmazó módon is el tud készíteni felhasználva a pSP64, pIJ702 plazmidokat, valamint a Micromonospora eredetű 4 kb vagy más hosszúságú, gentamicin-rezisztenciagént tartalmazó DNS-fragmentumokat. A találmány tárgya továbbá eljárás Micromonospora sejtek transzformálására a találmány szerinti hibridvektorokkal és az így kapott transzformáns Micromonospora törzsek. A transzformációhoz a lizozim enzimmel Micromonospora protoplasztokat képezünk és ezekbe juttatjuk be a találmány szeritni plazmidvektorokat előnyösen 40%-os PEG4000 (polietilén glikol) jelenlétében. (A transzformáció más koncentrációban, vagy PEG1000 és PEG6000 jelenlétében is elvégezhető.) A regenerálódó protoplaszt sejteket előnyösen a szélesztésüket követő 45-50. órában a tiosztreptont vagy más rezisztenciagént hordozó hibridvektor esetében az adott antibiotikumot tartalmazó agarral felülrétegezzük. A szelektív táptalajon az adott antibiotikummal, például a tiosztreptonnal szemben rezisztens telepek stabilan fenntarthatóak, és ezekből a plazmidvektorok izolálhatőak. A transzformáció hatékonysága 5-100 transzformáns/regenerált protoplaszt volt. A Micromonospora eredetű DNS-fragmentumot is tartalmazó pSG4 és pSGE5 hibridvektorok alkalmazásakor nőtt a transzformációs frekvencia. A továbbiakban a találmány szerinti hidridvektor előállítási és a transzformációs eljárást mutatjuk be részletes példákkal anélkül, hogy az oltalmi igényt ezzel korlátoznánk. 1. példa A pSE8 plazmid előállítása 1. Az E. coli K12 HB101lpSP64 elkészítése és a pSP64 plazmid előállítása Az E. coli K12 HB101 sejteket 100 ml L-boullion táptalajban (1% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% NaCl, pH-7,3-7,4) tenyésztettünk 37 °C-on a szaporodás logaritmikus fázisának közepéig, majd a kalciumionokkal ismert módon kompetenssé tett sejteket [Maniatis T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] transzformáltuk a pSP64 (Promega Biotec) plazmiddal. A transzformáció végén a baktériumsejteket 25 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agar (L-boullion +1,5% agar) táptalajra szélesztettük. Néhány Amp® telepből plazmidot izoláltunk [Maniatis T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)], majd agaróz gélelektroforézissel és restrikciós térképezéssel ellenőriztük, hogy az izolált plazmid és fragmentumai azonosak a 3 kb pSP64 plazmiddal. 2. A Streptomyces lividans TK64lpIJ702 elkészítése és a pIJ702 plazmid előállítása Streptomyces lividans TK64 spóraszuszpenziót 50 ml Y táptalajban (0,3% élesztőkivonat, 0,5% pepton, 0,3% húskivonat, 1,0% glükóz, 34,0% szacharóz, pH-7,0-7,2, majd autoklávozás után 0,005 M MgCh, 0,5% glicin) 28 °C-on tenyésztettünk 36-40 órán át, majd az ismert módon [Hopwood et al.: Genetic manipulation of Streptomyces, The John Inn es Foundation 12-13, 108— 109 (1985)] protoplaszttá alakított sejteket PEG1000 jelenlétében transzformáltuk a pD702 (ATCC 35287) plazmiddal. A transzformáció végén a protoplasztokat SR táptalajra [103% szacharóz, 0,025% K2SO4, 1,012% MgCh^őífcO, 1,0% glükóz, 1,0% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 03 v/v% nyomelemoldat (40 mg ZnCl2, 200 mg FeCl3*6H20, 10 mg CuC12*2H20, 10 mg MnCk*4HA 10 mg Na2B4OTl0H2O, 10 mg (NH4)6 Mo7024*4H20/liter), 2,6% Difcoagar, autoklávozás után 20 mM CaCl2, 0,005% KH2PO4, 25 mM Tris-HCl pH-7,6] szélesztettük. A 28 *C-on regenerálódó protoplasztokat 10-16 óra múlva 25 pg/ml tiosztreptonnal felülrétegeztűk. Néhány Tio® (tiosztrepton-rezisztens) telepből plazmidot izoláltunk [Hopwood et al.: Genetic manipulation of Streptomyces, The John Innes Foundation (1985)], majd agarózgél-elektroforézissel és restrikciós térképezéssel ellenőriztük, hogy az izolált plazmidok azonosak az 5,8 kb pU702 plazmiddal. 3. A pSE8 plazmid előállítása A pSP64 plazmidot BamHI restrikciós endonukleázzal, a pU702 plazmidot Bgin restrikciós endonukleázzal az enzimeknek megfelelő pufferekben (Pharmacia) emésztettük, majd a 3,0 kb BamHI fragmentumot és az 5,8 kb BglII fragmentumot T4 DNS-ligázzal összekapcsoltuk. A reakciót 100 pl térfogatban 0 'C-on végeztük 14-16 órán át 66 mM Tris-HCl, 6,6 mM MgCk, 10 mM ditiotreitol és 0,4 mM ATP, pH-7,5 pufferben 0,25 egység T4 DNS-ligázzal. A DNS-fragmentumok koncentrációját úgy választottuk meg, hogy az összekapcsolt két fragmentum kömé záródásának kedvezzen [Dugaiczyk et al.: J. Mól. Bioi. 96,171-184 (1975)]. A ligációs elegyeket használtuk ezután E. coli K12 HB101 sejtek transzformálásához. 2. példa Az E. coli K12 HB101lpSE8, valamint a Streptomyces lividans TK64/pSE8 transzformánsok előállítása Az E. coli K12 HB101 sejtek transzformációját az 1/3 példában kapott ligációs eleggyel az 1/1 példában leírtak alapján végeztük. A transzformált sejteket 25 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agar táptalajon szelektáltuk. Néhány Amp® telepből plazmidot izoláltunk, majd ezeket agaróz gélben elektroforetizáltuk. A megfelelő méretű (8,8 kb) rekombinált plazmidot (pSE8) kiválasztottuk és restrikciós térképezéssel meghatároztuk az összekapcsolt két fragmentum orientációját (1. ábra). A pSE8 plazmid vektorként használható az E. coli fajon kívül Streptomyces lividans fajban is. Streptomyces lividans TK64 sejteket transzformáltunk az 1/2 példában leírtak alapján pSE8 plazmiddal. Tiosztrep-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
