203783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására
1 HU 203 783 B 2 duktumcsúcs megjelenése (körülbelül 200 000 molekulatömeggel) mutat A SOD-hoz nem kapcsolódott szabad PEG-et ioncserélő kromtográfiával választjuk el a PEG-SOD-adduktumtól. A PEG-SOD-adduktum frakciókat az eluáló puffer ionerősségének nátrium-kloriddal történő emelésével gyűjtjük össze (pH-9). A PEG-SOD-frakciókat vízzel szemben dializáljuk a puffermaradék eltávolítására, majd fagyasztva szárítással vagy vákuum bepárlással koncentráljuk. Egy, az 50 mmól/liter koncentrációjú nátrium-kloriddal eluált termék tulajdonságait a következőkben példaként megadjuk. Az adduktum 24 mg SOD-proteint és 165 mg proteinhez kötött PEG-et tartalmaz. A proteintartalmat biuret analízissel és a PEG-tartalmat HPLC analízissel határozzuk meg refraktív index detekcióval (Rí), és korrigáljuk a protein EI-hez történő hozzájárulására. A proteinhez kötött PEG átlagos molekulatömege 72 000. Az adduktumokból proteolízissel felszabadított PEG mért molekulatömege, amelyet azon adatokkal kombináltunk, amelyek azt mutatják, hogy a SOD-protein (32 000 molekulatömeg) és a PEG aránya az adduktumban 24:165 mg, azt mutatja, hogy 3 PEG-lánc kapcsolódik 1 molekula SOD-hoz. Az adduktum ezen az alapon számított molekulatömege 220 000 (72 000*3+32 000*8), az eredmény megegyezik a HPLC-vel kapott molekulatömeggel. A fenti adduktum SÓD aktivitását citokróm-C vizsgálattal határoztuk meg [McCord és Fridovich, J. Bioi. Chem. 244,6049-6055 (1969)]. A PEG-SOD-adduktum fajlagos aktivitása (4317 egység/mg protein) a natív enzim kiindulási anyag specifikus aktivitásának 98%-a (4400 egység/mg). A termék tehát a natív enzim- vagy biológiai aktivitást lényegében megtartotta, míg kielégít más, előnyös feltételetet is. A kapott PEG-SOD-származékot immunológiai szenzitizáciős potenciál (anafilaktikus reakciót kiváltó aktivitás) szempontjából összehasonlítottuk a nagy tisztaságú, nem módosított SÓD kiindulási anyaggal felnőtt nőnemű Swiss Webster egereken szenzitizá-ciós tesztben. 10 egeret immunizáltunk két hét alatt adott négy szubkután injekcióval, 0,075 mg proteinnel dózisonként, majd 21 napos intervallumokban intravénásán adagolt 0,04 mg proteinnel provokáltuk. Az ötödik intravénás provokálás után a nem módosított SOD-ot kapott csoportban 5 állat elpusztult, és a többi 5 állat közül háromnál mutatkoztak az anafilaxis jelei. A PEG-SOD-adduktumot kapott 10 állat közül egynél sem mutatkoztak anafilaxis jelei. Amikor a vizsgálatot olyan PEG-SOD-adduktummal végeztük, amely SOD-molekulánként körülbelül 6 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazott, az ötödik provokálásnál 10 állatból 2 elpusztult, és a maradék állatokból négy mutatta az anafilaxis jeleit Tehát a találmány szerinti eljárással előállított SOD-molekulánként három 72 000 móltömegű láncot tartalmazó PEG-SOD-adduktum kevésbé volt immunogén, mint a kétszer annyi 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó PEG-SOD-adduktum. 2. Példa: PEG-SOD-addukt előállítása Az 1. példa szerinti módon nagy molekulatömegű PEG-eket kapcsolunk borjú Cu, Zn-SOD-hoz. Az öt 100 000 móltömegű PEG-láncot és a három 120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó termék kevésbé immunogén egerekben, mint a natív SOD-, illetve a négy 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó termék. 3. Példa: Felezési idő mérése A natív SÓD és az 1. példa szerinti eljárással előállított PEG-SOD-termékek szérumban való lebomlását vizsgáltuk felnőtt nőnemű Swiss Webster egerekben. 100 pg SOD-ot injektáltunk intravénásán. Vért vettünk szabályos időközönként, és a plazmát vizsgáltuk fajlagos PEG-SOD aktivitásra elektroforetikus módszerrel, amely elkülöníti a PEG-SOD-ot az egér SOD-tól. Egy két, körülbelül 65 000 móltömegű PEG-láncot és egy négy, körülbelül 40 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó PEG-SOD-adduktumok vizsgáltunk. A natív SÓD eltűnésének félideje az egerekben körülbelül 5-10 perc volt, míg a vizsgált PEG-SOD-adduktumok eltűnésének félideje több; mint 36 óra volt, és a PEG- SOD aktivitást a vérben ezen állatok esetén legalább 9 napig lehetett mérni: Egy másik készítmény, amely átlagosan 2,6, körűibe-, lül 45 000 móltömegű láncot tartalmazott, szintén 36. órát meghaladó felezési időt mutatott. a/ 4. Példa: Kapcsolási reakció cianur-kloriddal Egy PEG-termék (Union Carbide) vizes oldatát; amelynek belső viszkozitás alapján mért átlagos móltól mege 100 000, HPLC-vel mért átlagos móltömege viszont 50 000, Millipore Minitan készüléken, amely 300 000 móltömeg (protein standard) határértéket biztosító membránnal volt felszerelve, ultraszűréssel méret szerint frakcionáitunk. A méret szerint frakcionált terméket vákuumban megszárítottuk. A HPLC-vel végzett analízis azt mutatta, hogy a minta átlagos molekulatömege ultraszűrés után 50 000-ről 100 000-re emelkedett 3,77 g méret szerint frakcionált PEG 100 ml vízmentes acetonitrillel készült oldatához hozzáadtuk 1,39 g cianur-klorid 2,8 ml vízmentes acetonitrillel készült oldatát Az elegyet 3 napig 24 °C hőmérsékleten állni hagytuk, majd azonos térfogatú acetonitrillel hígítottuk, és leszűrtük. Az oldószert vákuumban 30 °C hőmérsékleten bepároltuk, és a maradékot 120 ml vízmentes toluolban oldottuk. A terméket 360 ml vízmentes hexán adagolásával kicsaptuk. A terméket toluolból még egyszer kicsaptuk petroléterrel, majd vákuumban megszárítottuk, így cianur- kloriddal aktivált PEG-et kaptunk. A méretkizárásos HPLC azt mutatta, hogy a PEG móltömege az aktiválás során nem változott. Különböző mennyiségű, a fenti módon aktivált PEG-et vizsgáltunk arra nézve, hgy mennyire képesek kapcsolni a szarvasmarha réz-cink-SOD-ot, amelynek állandó koncentrációja 1 mg/ml volt A végső PEG-koncentráció 5 és 100 mg/ml között volt 24 óra hosszat 24'C hőmérsékleten végzett reakció után az elegyetet HPLC vizsgálatban UV-detekcióval a PEG-SOD képzésére, és a maradék SÓD mennyiségére nézve vizsgáink. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
