203772. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklooktaamilóz előállítására
1 HU 203 772 B 2 xadeka-l,8-<iion, ciklohexadeka-l,9-dién, 17-oxa-biciklo[ 14.1,0]cikloheptadeka-8-én, 9,18-dioxa-tricik-lo[15.1.0.0®-10]ciklooktadekán, cikloheptadeka-9-én-1- -on, ciklohepta-l,9-dion, 18-oxa-biciklo[15.1.0]ciklooktadeka-8-én, 2,5-dioxa-l ,6-dioxo-ciklohexadekán, 2,5-dioxa-1,6-dioxo-cikloheptadekán, 2,8-dioxa-1 - -oxo-cikloheptadekán, 1,7-dioxa-1 -oxo-cikloheptadekán, 2-oxa-l-oxo-ciklotetradekán, 2-oxa-l-oxo-cikloheptadekán, 2-oxa-l-oxo-ciklopentadekán. A találmány szerinti eljárásnál keményítőként elvileg bármilyen keményítőt alkalmazhatunk, így például natúr keményítőket vagy részlegesen hidrolizált keményítőket, így például burgonya-, kukorica-, maniókakeményítőt vagy maltodextrint, amelynek dextróz ekvivalens értéke <15. Vizes keményítőkészítményként bármely készítményt felhasználhatunk, amelyet eddig keményítő enzimatikus hasításához alkalmaztak. Ezek általában gélesített keményítők 4-40 tömeg%-os vizes oldatai. E készítményeket egyszerű módon a megfelelő mennyiségű keményítő vízben való forralásával állítjuk elő. Az említett készítmények az enzimstabilizálás érdekében kis mennyiségű, így például 5-10 mmól/liter mennyiségű kalcium-kloridot is tartalmaznak. Az említett keményítőkészítményekhez az ismert ciklodextrin-glükozil-transzferáz (CGT) enzimet adagoljuk. Enzimforrásként például a következő mikroorganizmusokat alkalmazhatjuk: Bacillus macerans [Zentr. Bakteriül, Parasitenk., Abt n. 14, 722 (1905)], Bacillus stearothermophilus (3 988 206 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), Bacillus subtilis No. 313 (Agric. Bioi. Chem. 50, 8, 2161-2162 (1986)], Bacillus circulans (4 477 568 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), Bacillus ohbensis (52-31 949 számú japán szabadalmi leírás), Bacillus megaterium (3 812 011 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), Bacillus spec. No. 17-1 (3 923 598 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), Klebsiella pneumoniae M5 a L (Arch. Microbiol. Ill, 271 (1977)], Micrococcus luteus vagy Micrococcus variáns (mindkettő 0 017 242 számú európai szabadalmi leírás). Az enzimet előnyösen enzim:keményítő-(l:2000)(1:50 000), különösen (1:5000)-(1:20 000) aránynak megfelelő mennyiségben adagoljuk. A találmány szerinti eljárásnál előnyösen az enzim beadagolása után rögtön adagoljuk a komplexképző vegyületet, előnyösen a keményítő tömegére vonatkoztatott 1-20 tömeg%, különösen 8-15 tömeg% mennyiségben. A keményítőkészítmény pH-ja előnyösen 4-11, különösen 6-9,5 közötti érték. A hasítási reakciót előnyösen 30-60 ‘C, különösen 40-50 ”C közötti hőmérsékleten keverés közben, előnyösen 10-48 órán át végezzük. A reakció végbemenetelét időnkénti mintavétellel és kromatográfiás vizsgálattal [HPLC módszer, Agric. Bioi. Chem. 49, 4,1189-1191, (1985)] követhetjük. Az oldhatatlan ciklooktaamilóz komplexet ismert módon, így például dekantálással, szűréssel, centrifugálással választjuk el a többi anyagtól. Az elválasztást követően a kapott komplexet ismét ciklooktaamilóz- és komplexképző anyagra választjuk szét. Ezt a műveletet előnyösen forró vizes vagy vízgőzzel való kezeléssel végezzük, így például a komplexképzőt vízgőzdesztillációval választjuk el. Az elválasztást végezhetjük szerves oldószeres, így például toluolos vagy ciklohexános extrakcióval is. A kihozatal általában 48 tömeg%-ot megközelítő értékű (a kiindulási keményítőre számolva) és a tisztaság 95% körül van. Az így kapott ciklooktaamilózt ezután ismert módon glükózamilázzal kezeljük a magával vitt keményítőmaradék eltávolítására, majd ezt követően előnyösen szerves oldószerrel, így például alkoholokkal, például izopropanollal, metanollal vagy például acetonnal elkeverjük, amikor is hosszabb állás után a ciklooktaamilóz kikristályosodik. Az így nyert anyag tisztasága 95- 99,9%. A találmány szerinti eljárás előnye az ismert eljárásokhoz képest, hogy a ciklooktaamilózt nagyobb kitermeléssel nyerjük és a szelektív komplexképzőknek köszönhetően ezek tisztasága az elválasztás után több mint 90% és így az igen munkaigényes tisztítási művelet elkerülhető. A találmány szerinti eljárással előállított ciklooktaamilóz előnyösen alkalmazható növényvédő szerekben, gyógyszer-, kozmetikai- és élelmiszeripari készítményekben. 1. példa 20 g oldható burgonyakeményítőt 200 ml, 4 mmóí tri(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridot (pH-7,2) és 1 mmól kalcium-kloridot tartalmazó vízben szuszpendálunk, majd 95 *C-ra való melegítéssel 25 percig gélesítjük. Az így kapott anyagot 50 °C-ra visszahűtjük, hozzáadunk 2 mg Bacillus macerans-ból nyert ciklodextrin-glükozil-transzferáz-enzimet és 2,5 g ciklohexadeka-8-én-l-ont és keverés közben 36 órán át 50 *C hőmérsékleten inkubáljuk. Az alikvot rész HPLC analízise alapján a reakciókeverék a kiindulási keményítőre számolva 46 tömeg% ciklooktaamilózt tartalmaz. A nehezen oldható ciklooktaamilóz-ciklohexadeka-8-én-l-on-komplexet ezután centrifugálással elválasztjuk, 200 ml vízzel elkeverjük, ismételten centrifugáljuk és vízzel mossuk. Az így kinyert komplexet ezután 200 ml vízben elkeverjük és vizes azeotrop formában a ciklohexadeka-8-én-l-ont ledesztilláljuk. A kapott ciklooktaamilóz-oldat 92%-os tisztaságú ciklooktaamilózt tartalmaz. A még visszamaradó keményítő eltávolításához a ciklooktaamilóz koncentrációt 40 tömeg% értékre állítjuk be és 0,5 mg glukózamiláz jelenlétében 55 *C hőmérsékleten pH-5 értéken egy éjszakán án inkubáljuk, majd szobahőmérsékletre lehűtjük, azonos térfogatú izopropanolt adunk hozzá és 4 órán át 4 *C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kapott csapadékot elválasztjuk, izoropanollal mossuk és 60 *C-on vákuumban szárítjuk. A kitermelés 7,6 g ciklooktaamilóz, tisztasága 99%. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
