203637. lajstromszámú szabadalom • Táptalaj és eljárás rovarírtó nematódák folyékony tenyészetben történő előállítására
1 HU 203 637 B 2 amelyek nem feldolgozott nyers anyagok, és amelyek az élelmiszeriparban használatosak, továbbá könnyen hozzáférhetők. A táptalajt úgy állítjuk elő, hogy először összekeverjük az olajkomponenst és a tojássárgáját, utána ezt az olajos anyagot vízzel homogenizáljuk. Ezután a fennmaradó alkotóanyagokat hozzáadjuk a homogenizált keverékhez és autoklávban sterilizáljuk. Jóllehet a kezdeti keverési lépés elvégzése nem feltétlenül szükséges, azt találtuk, hogy az ilyen formákban készített táptalajok sokkal stabüisabb emulziók, mint az előzőek és a fertőző nematódák nagy hozamú termelését biztosítják. Ahogy említettük, a találmány tárgya eljárás fertőző entomogén nematódák széles skálájának folyékony tenyészetben nagy koncentrációban történő előállítására, amelynek során a találmány szerinti táptalajt előre beoltjuk a nematódákkal szimbiózisban élő baktériumokkal. Ahogy a szakterületen szokásos, előnyösen a baktérium-szaporulatot elsődleges formában használjuk. A szimbiózisban élő baktériumok adagolása fontos azért, hogy a lehető legnagyobb mértékben növeljük az eljárás hozamát és fokozzuk a nematódák fertőzőképességét a rovarokkal szemben. Közelítően 1 x 107 számú baktériumsejt fejlődik 1 ml táptalajra számítva körülbelül 24-48 óra alatt 25-30°C-on a nematódatenyészettel való beoltás előtt. Miután a baktériummal beoltott tenyészetet bevittük a táptalajba, a levegőáram sebességét körülbelül 1 fermentortérfopt/perc nagyságra állítjuk be és a keverési sebességet úgy választjuk meg, hogy az oldott oxigént 50%-os telítési szintre szabályozzuk, bár más körülményekkőzött elegendő oxigén szállításáról gondoskodunk a tenyészet számára. A juvenü nematódák vagy fertőző nematódák, vagy J1-J4. állapotú nematódák, de a J3. állapotú nematódaforma az előnyös. A nematóda-inokulum koncentráció változhat 100-5000 nematóda/ml nagyságban. Asematóda-beoltás idején a nyomást egészen 3 bárig növelhetjük, ha nagyobb mennyiségű oxigénre van szükség. Mihelyt a fermentáció során a kifejlett állapotú nematódák feldúsulnak, a baktériumcseppek kívánt oxigénszükséglete megnő és így a keverést csökkenteni kell. Beoltás után a hőmérséklet lecsökken 20-28 °C-ra a nematódatörzstől függően, és ezt a hőmérsékletet a tenyészet fejlődése folyamán megtartjuk. A találmány szerinti eljárás egy specifikus kiviteli módjánál, amelynél Erlenmeyer-féle rázólombikot használunk, a fermentációs tenyészetet 1:4 - 1:8 arányban tartjuk a lombik térfogatához viszonyítva. A tenyészetet 150 ford/perc sebességgel forgó rázógépen rázzuk a tenyésztés teljes időszakában, amely 10-16 napot vesz igénybe. A kevert tartályos reaktor egy előnyös fermentáló edény, amely nem áll ellen azoknak a nyíróerőknek, amelyek az üyen edényekben keletkeznek. Abban az esetben, ha körülbelül 1 fermentortérfogat/perc levegőáramsebességet tartunk fenn a fermentálás során, akkor a keverési sebességet meglehetősen magas szinten tartjuk azért, hogy hozzáigazítsuk az oxigénváltozáshoz, amelyre a tenyészet bármelyik fejlődési állapotában szükség van anélkül, hogy káros hatás jelentkezne a fertőző juvenüek keletkező hozamára. Ahogy később részletesebben leírjuk, a tenyészet nyírással szembeni érzékenységét meghatározzuk különböző fejlődési állapotokra és a fermentációs tenyészetek velejáró oxigénszükségleteire, így megállapítjuk a keverési sebesség felső paramétereit. A juvenüek második generációja koncentrációját meghatároztuk a 8. naptól kezdve aló. napig tartó fermentációs időszakaszban és azt találtuk, hogy nagyobb reprodukciós szintek jelentkeztek, mint más tápközegeknél, amely 200-szoros növekedést is felülmúlt generációnként és rövidebb idő alatt, például 10- 16 nap alatt, hozott létre fertőző juvenüeket, mint más említett módszerek. így a találmány szerinti táptalaj és eljárás használatával nagy skálájú entomogén nematódákat tudunk könnyen tenyészteni, nem-költséges, könnyen hozzáférhető alkotóanyagok felhasználásával. A szakaszos előállítási eljárást fent leírtuk, de a találmány kiterjed egy „adagolt szakaszos” eljárásra is, amelynél a táptalajt újra betápláljuk a J3. és J4. fejlődési állapot során. Ez a módszer egy további táplálékforrást jelent a fermentációs tenyészet számára és felülmúlhat bármely táplálékkorlátozó körülményt. A találmány kiterjed olyan módszerre is, amely fenntartja a baktérium- és nematódafejlődést valamely kevert edényben, amelyben a keverési sebesség változik az oxigénbevitel változásának a körülményei szerint és így differenciáltan optimális körülményeket teremt a nematódareprodukció és -fejlődés számára. A kevert edényekben létesült körülményeket legnehezebb előre megbecsülni, de kritikusak a szükséges nematódatermeléshez. A kritikus paraméterek a hőmérséklet, az oldott oxigén tenziója, a nyírófeszültség és a fizikai terhelés más eszközei. Az eljárás hőmérséklete könnyen optimálissá tehető kis edényekben vagy statikus tenyészetekben. Az optimális hőmérséklet meghatározása nem bizonyult nehéznek nagy edényekben. Az oldott oxigén közelítőleg 42,656 x 102 Pa felett van és e felett a nyomás felett keü tartani az eljárás legnagyobb részében, de 53,32 x 102 Pa-nál nagyobbnak és előnyösen 106,64 x 102Pa-nál nagyobbnak kell lennie az oxigénnyomásnak, ha a kifejlett egyedek kialakulnak és petéket raknak. Ilyen körülmények kialakításának a nehézsége kevert tartályokban függ az eljárás oxigénszükségletétől és az oxigénbevitel sebességétől. Az oxigénbevitel sebessége a levegő áramlási sebességétől, a buborékok méreteloszlásától és a keverés mértékétől függ. A legnagyobb oxigénszükséglet a leírt eljárásnál körülbelül 20 mmól/óra, de más időknél a fermentáció során lehet 5 mmól/óra vagy ennél kisebb is. A kritikus oxigén tenzió fenntartása kevert tartályreaktorokban a legnagyobb oxigénszükséglet során nagy keverési sebességet igényelhet. Már régen felismerték, hogy erőteljes keverés gátolhatja a nematódareprodukciót [Stoll, N. (1953) J. Párásítói 39:422-444], Pace et al. az említett helyen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
