203637. lajstromszámú szabadalom • Táptalaj és eljárás rovarírtó nematódák folyékony tenyészetben történő előállítására
1 HU 203 637 B 2 A találmány rovarirtó nematódák folyékony tenyészetben történő előállítására és a táptalajra vonatkozik. A találmány magában foglal olyan rovarirtó módszert is, amelynél biológiai szereket használunk a mezőgazdaságban, a kertészetben és a háztartásban tenyésző rovarok irtására. A találmány tárgya különösen eljárás rovarokra nézve parazita nematódák (fonalférgek) nagy mennyiségben való előállítására javított táptalaj és optimális tenyésztési körülmények alkalmazása mellett. A nematódák a nem-szegmentált hengeres testű férgek egy csoportját képviselik. Egyszerű a testfelépítésűk egyetlen béllel és nyújtott orsóalakkal rendelkeznek. A nematódák számos családra oszlanak, amelyek némelyike szabadon élő, míg mások élősködnek a növényeken vagy az állatokon. Azokat a nematódákat, amelyek a rovarokra nézve paraziták, entomogén (rovarokban fejlődő) vagy entomopatogén (rovarokra káros) nematódáknak nevezzük. Rovarirtás szempontjából gazdaságilag a legnagyobb érdeklődésre számottartó rend a Rhabditida rend, amely néhány olyan családot foglal magában, amelyek közül számos élősködik rovarokban. Kiemelkedők ezek között a családok között a Steinemematid és a Heterorhabditid családok. A nematódák osztályozásának általános ismertetését és ezek entomogén családjait Poinar, G. O. írta le a „The Natural History of Nematodes“ (1983), Prentice-Hall Inc., N. J. irodalomban. A nematódáknak szabványos életciklusuk van, amely öt fejlődési állapotot foglal magában. Ezek a vedlési folyamatból indulnak, amelynek során először új kutikula (felhám) képződik és végül a régi kutikula lehámlik. Röviden, a kifejlett 5. állapotú nematódák reprodukálnak és a peték létrehoznak 1. állapotú lárvákat, amelyek megfelelő körülmények között 2. állapotba mennek át. Rendes körülmények között a 2. állapotú lárvák 3. állapotú lárvákká fejlődnek és innen a 4. állapotú lárvákká alakulnak, amelyek azután befejezik a ciklust és kialakítják a kifejlett 5. állapotot. A rovarok irtására akkor jön számításba a nematódák használata, amikor a körülmények viszonylag kedvezőtlenek a fejlődés és a reprodukció folytatására, a 2. állapotú Steinemematid és Heterorhabditid lárvák inkább „3 állapotú fertőző juvenü”-ekké vagy röviden „U”-vé alakulnak. Ilyen körülmények között a második állapotra jellemző kutikula fennmarad és ezt nevezzük toknak. Ez teljesen körülzárja a nematódát. Az H-k fertőzők a rovarokra és teljessé teszik az életciklusukat a 4. állapoton át a kifejlett állapotba a gazdarovar kárára. A Steinemematid és a Heterorhabditid U nematódák hatásos eszközök rovarok irtására. Ezek azonosíthatók morfológiailag és rendes körülmények között szilárd részecskéket körülvevő felületi vízfilmekben élnek. Ezek oxigént és nedvességet igényelnek a túléléshez, de nem kívánnak táplálékot, mivel a saját tápanyagtartalékukat fogyasztják energiaforrásként. Akkor is fertőzők maradnak, ha a tokot levedlik. Egy más szempontból tekintve a Steinemematid és a Heterorhabditid nematódák biológiaüag jelentősek, mivel ezekbe a családokba tartozó nematódák szimbiózisban vannak olyan baktériumfajtákkal, amelyek elsődlegesen, de nem teljesen felelősek azok entomopatogén tulajdonságaiért. A nematódák fejlődése kedvezőbb a társult együttélők jelenlétében, valószínűleg azért, mert az együttélő könnyen asszimilálható táplálékforrásként szolgál. Entomogén nematódák tömegtermelésére javasolták a Bedding-féle egygazdás tenyésztési módszert [(1984) Ann. Appl. Bioi. 104:117 - 120]. A Beddingféle módszernél olyan műanyaghabból álló szüárd fázisú mátrixot alkalmaznak, amely homogenizált állati szövettel van impregnálva, amelyben a nematódák fejlődnek. A technika jól levegőztetett alapot biztosít mind a szimbiózisban élő baktérium, mind a nematóda számára. A Bedding-féle módszert használják 109 számú nematóda szakaszos termelésére, de a hatékony felvevőpiac ennek a mennyiségnek a 10000-szeres termelését igényli. A Bedding-féle módszer javított változata költséges automatizált eszközt igényelne, nehezen lehetne aszeptikus állapotban tartani és nehézségek jelentkeznének a közeg készítése és a nematódák begyűjtése terén is. Egy folyékony egygazdás eljárással áthidalhatók lennének ezek a korlátok. Az entomogén nematódák folyékony, egygazdás tenyészetei szokásosan a rovar-vémyirok kis cseppjeiben növekednek. Parazitamentes (steril) tenyészetekről már említés történt, de ezek hatásossága korlátozott és költséges táplálék-adalékokat igényelnek. így például a táplálkozási vizsgálat folyamán 100 ml-nél kevesebb folyékony tápmennyiséget használt Stoll, N. (1961) J. Helminthol, Lister Suppl, pp. 169-174; Jackson, G. J. (1973) Exp. Párásítói 54:111-114; Hansen, E. et al. (1967). 42nd Ann. Meeting Am. Soc. Párásítói; Lower, W. M. R. et al. (1970) Nematologia 76:563- 566; és Beucher, E. J. et al (1970) Nematologia 76:403-409. Ezek az irodalmak azt mutatják, hogy a nematódák biológiai és fiziológiai követelményei egymásra találhatnak folyékony szuszpenzióban. Bizonyos eszközök szükségesek ezeknek a tenyészeteknek a levegőztetésére és ez végezhető vékony folyadékrétegbe való diffúzióval, rázással vagy átbuborékoltatással. A nagyobb nehézségek egyike egy folyékony, egygazdás tenyészet kifejlesztésében a megfelelő levegőztetés biztosítása mind a baktériumok, mind a nematódák számára anélkül, hogy a nematódák túlságos nyíróerőknek legyenek kitéve. Ismeretes egy módszer C. elegáns szabadon élő nematóda folyékony, egygazdás kultúrában történő tenyésztésére. Ennél a módszernél baktériumokat szuszpendálnak nematódákkal együtt nem-táplálék sóoldatokban. Ilyen körülmények között kevés szabad tápanyagot kapnak az anyagcsere számára és ezért kevés oxigént igényelnek. A találmányhoz vezető kutatásaink folyamán felismertük, hogy ugyanezt a technikát használhatjuk N. carpocapsae tenyésztéséhez, amennyiben egy szterin-adalékot adagolunk. Azt találtuk azonban, hogy a baktériumok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
