203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B állnak, amelyek Öregei életképes E. coli vagy S. marcescens szerotípusok keverékét tartalmazzák az üreg felületére rögzítve poli-L-lizinnel (PLL). Röviden, 50 pj PLL-t (1 pg/ml, PBS-ben oldva) adunk mindegyik üregbe 30 percig szobahőmérsékleten. A lemezeket háromszor mossuk PBS-sel, és vagy PBS- t, vagy 50 pl kevert baktérium szuszpenziót (OD 664)0,2) adunk hozzá minden egyes üreghez. A lemezeket 37 'C hőmérsékleten inkubáljuk 60 percen át, és háromszor mossuk fiziológiás sóoldat/0,02% Tween 20 keverékkel (só/T), hogy eltávolítsuk a nem rögzített baktériumokat. Különböző antigén-lemezeket alkalmazunk az átvizsgálásban, beleértve a következőket: 1.) E. coli 01 szerotípus (ATCC 23499) és 04 szerotípus (ATCC 12791) keveréke; 2.) Serratia marcescens 07,015,016 és 018 szerotípusok keveréke (a törzsek tipizálására vonatkozó összes referenciát a Communicable Disease Center-ból (CDC), Atalanta, GA) kaptuk; és 3.) mikrotitráló lemez baktériumok nélkül. Az ELISA eljáráshoz a vizsgáló üregeket először 200 pl alábbi keverékkel blokkoljuk: 5% (tömeg/térfogat) száraz, sovány tejpor, 0,0001 t/tf% „Anti-foam A” (a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, által forgalomba hozott habzásgátló) és 0,01 t/tf% „Thimerosal” (Sigma Chemical Co., nátrium-etil-merkuri-tioszalicilát) 500 ml PBS-ben; üyeu módon akadályozzuk meg a nem fajlagos fehérje-kötést. 1 órás, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a lemezeket háromszor mossuk 200 pl/üreg mennyiségben só/T oldattal. Mindegyik üreghez 50 pl alábbi keveréket adunk. 0,1% Tween 20 és 0,2% szarvasmarha szérum albumin PBS-ben, ezt az oldatot a továbbiakban PTB-nek nevezzük. A tenyésztő lemezek üregeiből származó felülúszókat replika módszerrel átvisszük az antigén és a kontroll lemezek (50 pl/üreg) megfelelő üregeibe, és szobahőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk. A felülúszókat azután eltávolítjuk, a lemezeket ötször mossuk só/T oldattal, és 50 pl biotinilezett kecske antihumán immunglobulint (lg) (TAGO, Na 9303040, 1:250 arányban PTB-ben hígítva) adunk minden egyes üregbe. 30 perces, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a biotinilezett reagenst eltávolítjuk, az üregeket ötször mossuk só/t oldattal, és 50 pl előre elkészített „Avidin” biotinüezett tormaperoxidáz komplexet (amely a „Vectastain ABC Kit” részeként a Vector Laboratories Inc., Burlingame kalif ornia cégtói szerezhető be) adunk minden egyes üreghez. 30 perc szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a Vectastain ABC reagenst eltávolítjuk, az üregeket ötször mossuk só/T oldattal, és 101 pl szubsztrátumot (0,8 mg/ml orto-fenüén-diamin dihidroklorid 100 mmól/1 citrát puff erben, pH 5,0+0,03% H202 ionmentesített vízben, közvetlenül a lemezre helyezés előtt összekeverve egyenlő térfogat arányban) adunk minden egyes üreghez. 30 perces, sötétben végzett inkubálás után 50 pl 3 n H2S04-et adunk minden egyes üreghez, hogy leállítsuk a reakciót. Azokat a tenyészet felülúszókat, amelyek a lemezeket fedő baktériumokkal reaktívak, a 490 nm-nál mért abszorpcióval mutatjuk ki, a mérést Dynatech MR 580 micro ELISA leolvasóval végezve. Hat transzformációból kapott tenyészet felülú-15 szókat elemzünk a fenti módszerrel, végeredményben egy olyan üreget (7D7) azonosítunk, amely aktivitással bír E. coli és S. marcescens szerotípusú lemezeken, de nem rendelkezik aktivitással a kontroll lemezeken. Meghatározzuk egymást követően ELISA mérésekben egyedi E. coli szerotípusokkal, hogy ez az üreg olyan antitestet tartalmaz, amely reaktív legalább az E. coli szerotípusokkal: 08 (ATCC 23504) és 075 (ATCC 12798), de nem reaktív a 04, 06K2,08:K8,09:K9 vagy 022X13 szerotípusokkal (ATCC 12791,19138,23501,23505 illetve 23514). Ez az üreg továbbá tartalmaz olyan antitestet, amely reaktív a S. marcescens 012,013és015 szerotípusaival, de a S. marcescens további 20 ismert LPS szerotípusával nem. D. Fajlagos antitest-termelő sejtek klónozása A 7D7 üregben levő sejteket több (négy) klónozási menetnek vetjük alá, amíg mindegyik, fenti ELISA módszerrel mért klónozó felülúszó pozitív reakciót ad E. coli 08 és 075 és S. marcescens 012,013 és 015 szerotípusokra. Soha sincsen arra példa, hogy bármelyik klónozó felülúszó elkülönülést mutatna reaktivitási spektrumában, ez azt sugallja, hogy a 7D7 üregből származó tenyészet felülúszó valódi nemzetségek közötti kereszt-reaktivitással bír a bemutatott E. coli és S. marcescens szerotípusokra, és nem tartalmaz egynél több sejtvonalat (mindegyik egyedi szerotípus reaktivitást mutat). Asejteket határhígítással klónozzuk kerek fenekű, 96 üreges lemezeken, tápláló sejtek távollétében. A tápközeg Iscove tápközegből áll, amely 15% (térfoga t/ térfogat) FBS-t, L-glutamint (2 mmól/1), nátrium-piruvátot (1 mmól/1), penicillint (100 nemz. egység/ml), és sztreptomicint (100 pg/ml) tartalmaz. A tenyészetet minden harmadik napon tápláljuk a felülúszó felének helyettesítésével friss tápközeggel. Általában az üregek megfelelő lifoblasztoid-sejt sűrűséget érnek el a lemezre helyezéstől számított 2-3 héten, hogy elemezni lehessen anti-E. coli és S. marcescens szerotípus fajlagosságra. így ebben a kísérletben klónozott, transzformált humán sejtvonalhoz jutunk, amely folyamatos (nem-pusztuló) és humán monoklonális antitestet választ ki egy determináns ellen, amely a bemutatott E. coli és E. marcescens szerotípusok felületén van. A jelen szabadalmi bejelentés benyújtása előtt a folytonos transzformált humán sejtvonalat, amelyet 7D7-ként azonosítunk, elhelyeztük az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland) ATCC CRL 9009 letéti számon. E. A nemzetségek közti kereszt-reaktivitás további jellemzése A klónozott 7D7 sejtvonalból származó antitestet megvizsgáljuk további nemzetségek közötti kereszt-reaktivitásra, standard immunfoltképzési technika módosított formájának segítségével. Részletesebben, a K. pneumoniae, E. aerogens és E. cloacae baktériumokra való kereszt-reaktivitást vizsgáljuk baktériumok foltját behálózott nitrocellulóz papírlemezre helyezve, a baktériumokat tartalmazó lemezt az említett antitestekkel reagáltatva, és az antitest reakciókat alkálikus foszfatáz/nit-16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
