203581. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás optikailag aktív 3-fenil-glicidilsav-észterek előállítására
HU 203681 B mutabilis ATCC 33015, Serratia liquefaciens ATCC 27592, Serratia marcescens ATCC 13880, ATCC 14764, AZCC 19180, ATCC 21074, AZCC 27117 és ATCC 21212, Candida parapsilosis IFO 0585, Saccharomycopsis lipolytica IFO 0717, IFO 0746 (NRRLY-1095), IFO 1195, IFO 1209 (NRRL Y-1094) és DFO 1548, Nocardia asteroides IFO 3384 (ATCC 330), IFO 3424 és IFO 3423, Nocardia gardneri ATCC 9604 stb. Ezek a mikroorganizmusok lehetnek vad vagy mutáns törzsek. Mind a mikroorganizmusokat tartalmazó fermentlevet, mind magukat a mikroorganizmus sejteket szokásos módon nyerhetjük. A mikroorganizmust szokásosan alkalmazott tápközegben, szénforrást, nitrogénforrást és szokásosan használt szervetlen sókat tartalmazó tápközegben, szobahőmérsékleten vagy melegítés mellett, előnyösen 20-40 °C hőmérsékleten aerob körülmények között, pH - 5-8 értéken tenyésztjük, és kívánt esetben a fermentléből a sejteket ismert módon elkülönítjük és gyűjtjük. A tenyésztés során az enzimaktivitást fokozhatjuk azzal, ha (I) általános képletű 3-fenil-glicidüsav-észtert adunk a közegbe 0,001 tömeg/térf% feletti mennyiségben, különösen 0,1-1 tömeg/térf% mennyiségben. A fenti mikroogranizmus sejtekből nyert feldolgozott készítményekként említhetjük például a liofüizált sejteket, az acetonos szárított sejteket, a sejtek önfeltárásával nyert terméket, a sejtextraktumokat, az őrölt sejtterméket, a sejtek ultrahangos kezelésével nyert terméket. A mikroorganizmus sejtek és ezek feldolgozott termékei továbbá ismert módon immobüizálhatók a felhasználás előtt, alkalmazhatjuk például a poliakrilamid módszert, a kéntartalmú poliszacharid gél módszer (karragén gél módszer), az alginsav-gél-módszert, valamint az agar-gél-módszert. A találmány szerinti szteroszelektív hidrolizálási eljárást az enzimek a racém (I) általános képletű 3- fenü-glicidilsav-észterrel megfelelő oldószerben való reagál tatásával végezzük. A szubsztrát koncentrációja előnyösen 0,05-20 tömeg/térf.%, még előnyösebben 0,5-5 tömeg/térf.%, a reagáltatást célszerűen szobahőmérsékleten vagy melegítés mellett, előnyösen 10 és 50 °C között, még előnyösebben 25 és 40 °C között végezzük. A reagál tatás során előnyösen a reakcióelegy pH értékét 5 és 10 között, előnyösen 6 és 9 között tartjuk. Ebben az esetben, mivel a szubsztrátok nagyobb része nehezen oldódik vízben, előnyösen kétfázisú oldószerrendszerben végezzük a reagáltatást, amely rendszer vízből vagy vizes oldatból és egy szerves oldószerből áll. Szerves oldószerként alkalmazhatunk például szén-tetrakloridot, kloroformot, diklór-metánt, triklór-etüént, klór-benzolt, benzolt, toluolt, xilolt, terc-butü-metü-étert, diizopropil-étert, dietil-étert, metil-ziobutil-ketont, metü-etü-ketont, etil-acetátot, butil-acetát, n-propüalkoholt, izopropü-alkoholt, n-butü-alkoholt, tercbutü-alkoholt, különösen előnyös az etü-acetát, a szén-tetraklorid és a toluol alkalmazása. Ha enzimforrásként fermentlevet vagy mikroorganizmus sejteket alkalmazunk, a fenti reakciót célszerűen felületaktív szer jelenlétében hajtjuk végre, hogy a re3 akcióidőt lerövidítsük és az optikaüag aktív (I) általános képletű 3-fenü-glicidflsav-észter hozamát növeljük. Felületaktív szerként alkalmazhatunk például cetü-piridinium-bromidot, cetü-trimetü-ammónium-bromidot, polietüénglikolt, poli(oxi-etilén)-oktil-fenfl-étert. A felületaktív szert előnyösen a reakcióelegy teljes mennyiségére számított 0,0001-0,1% mennyiségben alkalmazzuk. A kapott reakcióelegyből az optikaüag aktív (I) általános képletű 3-fenfl-glicidilsav-észtert ismert módon könnyen elkülöníthetjük. Például, ha a hidrolizálási reakciót kétfázisú víz-szerves oldószer rendszerben végezzük, az (I) általános képletű 3-fenü-glicidilsav-észter egyik optikaüag akti vizomerje hidrolizál, és a vizes fázisba megy át, míg a másik optikailag aktív izomer, amelyet a reakció nem érint, a szerves oldószerben marad. így az optikaüag aktív 3-fenü-glicidüsav-észter kristályos formában kinyerhető a szerves oldószeres fázis elkülönítésével és bepárlásával. A találmány szerinti eljárással az optikaüag aktív (I) általános képletű 3-fenü-glicidilsav-észterek rövid eljárással és mégis nagy tisztaságú kristályok formájában előállíthatok, így ez az eljárás nagyüzemi eljárásra előnyös. A következő példákban „%” megjelölésen mindenütt tömeg%térfogat%-ot értünk. 1. Példa 500 ml térfogatú rázólombikba 50 ml pH = 7,0 értékű, 0,5% glükózt, l%peptont, 1% húskivonatot, 1,25% élesztőkivonatot és 0,5% nátrium-kloridot tartalmazó tápközeget mérünk, majd ezt 120 °C hőmérsékleten 10 percig sterilezzük. A tápközeget egy platinakacsnyi Serratia marcescens ATCC 27117- tel beoltjuk, és a tenyészetést 30 °C hőmérsékleten, 20 órán át rázatás meüett végezzük. 5,4 liter fenti tenyészetből centrifugálással kinyert mikroorganizmus sejteket fiziológiás NaCl-oldatban szuszpendálunk, és a sejteket ismét kicentrifugáljuk. A kapott sejteket 1,8 liter 10 mmól/literes, 0,01% cetü-trimetü-ammónium-bromidot tartalmazó, pH - 7,5-ös foszfátpuff erben szuszpendáljuk, majd hozzáadjuk 7,2 g racém metü-3-(4-metoxi-fenü)-glicidátot tartalmazó 1,8 liter szén-tetrakloridhoz. A sztereoszelektív hidrolízist 30 °C hőmérsékleten 3 napon át végezzük, minek során a metil-(2S, 3R)-3- (4-metoxi-fenü)-glicidát teljesen hidrolizált. A szén-tetrakloridos fázist elkülönítjük, majd vákuumban bepároljuk. így 3,0 g metü-(2R, 3S)-3-(4- metoxi-fenü)-glicidátot nyerünk nyers kristályok formájában. A 3,0 g nyers kristályhoz 10 ml izopropil-alkoholt adunk, az elegyet 80 °C hőmérsékleten keverés meüett 20 percig melegítve oldattá alakítjuk, majd 80 °C-ról 20 °C-ra fokozatosan, 3 óra alatt hűtjük le. Az elegyet ezután 1 órára jégbe hűtjük, és a kicsapódott kristályokat kiszűrjük. így 2,9 g kristályos metil-(2R, 3S)-3-(4-metoxi-fenü)-glicidátot nyerünk. O.a-87-88 *G [ajZ0D: -207,08° (c = 1, metanol) Tisztaság: 100% Elemzési eredmények: számított: C% « 63,45, H% = 5,81,0% - 30,74; talált: C% = 63,44, H%=5,80,0% = 30,76. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
