203580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a GE 2270 antibiotikum A faktor és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203580B 5 III. Táblázat folyt. Szénhidrát-felhasználás Szénforrás Növekedés raffinózcellulózmannitszalicin + mozit + cellobióz-Jelölések: +mérsékelt növekedés +/- gyér növekedés -nincs növekedés Ehhez a vizsgálathoz az JSP 8 táptalajt (E. B. Shirling and D. Gottlieb, (1966) Method for characterisation of Streptomyces species — int. f. Syst. Bacteriol) alkalmazzuk, és az eredményeket 2 héten át 28-30 °C-on végzett inkubálás után értékeljük. Hőmérséklet-érzékenység: Az optimális növekedési hőmérséklet 28-37 °C. Nem figyelhető meg növekedés 15 °C-on és 50 °C- on; mérsékelt a növekedés 20 °C-on. Kemotaxonómiai jellemzők Sejtfal-elemzés A sejtfalban jelenlevő aminosavak elemzését a Becker és munkatársai által leírt módszerrel (Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates. Appl. Microbiol. 12, 421-423, 1964) végezzük. A teljes sejt hidrolizátumának elemzése mezodiamino-pimelinsav jelenlétére mutat. Nem találunk glicint annaka tiszta sejtfal készítménynek a meghatározása során, amelyet Kawamoto és munkatársai (I. Kawamoto et al., Cell wall composition of Micromonospora olivoasterosporia, Micromonospora sagamiensis and related organisms, J. Bact. 146,527-534,1981) módszere szerint állítottunk elő. A teljes sejt cukor metabolizmusa A teljes sejt hidrolizátum cukor-tartalmának meghatározását M. P. Lechevalier módszerével végezzük (Identification of aerobe Actinomycetes of clinical importance. J. Lab. Clin. Med. 71,934-944, 1968), vékonyrétegkromatográfiás cellulóz-lemezek alkalmazásával, a J. L. Staneck és G. D. Roberts által leírt módon (Simplified appreach to identification of aerobic Actinomycetes by thin layer chromatography. Appl. Microbiol. 28, 226-231, 1974), a következő oldószer-rendszerrel: etilacetát:pirimidin.víz 100:35:25 térfVtérf. A kapott eredmények arra mutatnak, hogy maduróz (3-O-metü-D-galaktóz) van jelen és nincs jelen arabinóz és galaktóz. A Planobispora rosea ATCC 53773 törzs azonosítása Ezt a törzset a Planobispora genusba soroljuk és Planobispora rosea-ként osztályozzuk, a következő morfológiai és kémiai jellemzők alapján: a) a sejtfalban mezo-diamino-pimelinsav van jelen és hiányzik a glicin (in. kemotípusú sejtfal) b) a teljes sejt hidrolizátumában maduróz van jelen (B típusú teljes sejt cukor metabolizmus) c) a légmicéliumon hosszú és hengeres spóratartók képződnek, amelyek egy pár mozgékony spórát tartalmaznak d) a vegetatív micélium rózsaszínű. A Planobispora rosea ATCC 53773 fent leírt morfológiai jellemzői nem különböznek lényegesen annak a Planobispora rosea törzsnek a jellemzőitől, amelyeket J. E. Thiman et al. ír le (The Actinomycetales. The Jena Intem. Symp. on Texon., 1968 szeptember. Kiadó: H. Prauser, Jena). Ezt az ATCC-ben helyezték letétbe, 23866 letéti számon. Erről a törzsről nem írnak le antibiotikum termelést. Mint más mikroorganizmusok, a GE 2270-t termelő törzsek jellemzői is változásoknak vannak kitéve. A törzs mesterséges variánsai és mutánsai állíthatók elő pl. különböző ismert mutagénekkel — így UV besugárzással, X-sugárral, nagyfrekvenciájű hullámokkal, radioaktív sugarakkal — és vegyszerekkel (amilyen pl. a salétromossav, N-metil-N’nitro-N-nitrozo-guanidin és számos más anyag). Minden olyan természetes és mesterséges variánst és mutánst, amely a Planobispora rosea ATCC 53773-ból származik és GE 2270 antibiotikumot termel, egyenértékűnek tekintünk a Planobispora rosea ATCC 53773 törzzsel, a találmány céljai vonatkozásában és a találmány oltalmi köréhez tartozónak tekintsünk. A GE 2270 antibiotikum általában főként a termelő törzs micéliumában fordul elő, míg kisebb mennyiségű anyag található a fermentlében is. A GE 2270 antibiotikumnak a micéliumból vagy a termelő törzs fermentlevéből való kinyerését ismert eljárások segítségével végezzük, amilyen az oldószeres extrakció, kicsapás nem-oldószerek hozzáadásával vagy az oldat pH-jának megváltoztatásával, megosztásos kromatográfia, fordított fázisú megosztásos kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, molekula-kizárásos kromatográfia stb. Egy kitüntetett eljárás szerint, amely a találmány szerinti antibiotikumnak a micéliumból való kinyerésére irányul, a szűrt vagy centrifugált micéliumot egy vízzel elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk, az extraktumokat betöményítjük és a nyers antibiotikumot kinyerjük:- kicsapással, előnyösen egy kicsapószer hozzáadásával;- a vizes maradéknak egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel végzett extrakciójával vagy- adszorpciós kromatográfiával, amelyet a keresett terméknek az abszorpciós mátrixból való eluálása követ. Kitüntetett eljárás a szóbanforgó antibiotikumnak a fennen tlébő való kinyerésére az extrakció egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, majd a betöményített extraktumokból való kicsapással — célszerűen egy kicsapószer hozzáadásával—vagy a vizes maradék további extrakciója egy vízzel nem elegyedő oldószerrel. Egy másik megoldás szerint a fermentlevet egy adszorpciós mátrixszal hozzuk érintkezésbe, majd egy poláris eluciós eleggyel eluá-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
