203580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a GE 2270 antibiotikum A faktor és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203580B A rajzok rövid ismertetése Az 1. ábra a GE antibiotikum A faktor UV spektrumát mutatja be. A jelzésekés az alkalmazott oldószerek között az összefüggés a következő: CH30H kör 0.1NHC1 Négyzet 7,4 pH-jú foszfát puffer háromszög O.INKOH A 2. ábra a GE 2270 antibiotikum A faktor IR abszorpciós spektrumát (nujol mullpólyában) mutatja be. . A 3. ábra a GE 2270 antibiotikum A faktor n- NMR spektrumát mutatja be, 500 MHz-en DMSO- dbban felvéve. A 4. ábra a GE 2270 antibiotikum A faktor 1 CNMR spektrumát mutatja be, 125 MHz-en, DMSO-d 6-ban. A következő példák részletesebben szemléltetik a találmányt. Nem kívánjuk azonban igényünket a példákra korlátozni. 1. példa A GE 2270 antibiotikum előállítása Planobispora rosea ATCC 53773-at zabliszt ferdeagar lemezen 2 héten át 28-30 °C-on tenyésztünk, majd 1-1 kémcsövet 500 ml-es lombikok beoltására használunk fel, amelyek 100-100 ml, a következő összetételű inokulum-táptalajt tartalmaz21 nak: Keményítő 20 g/1 polipepton 5f/l élesztőkivonat 3 g/1 szarvasmarha-kivonat 2 g/1 szójaliszt 2 g/1 kalcium-karbonát 1 g/1 desztillált víz, q.s. 100 ml Sterilizálás előtt pH 7,0-ra beállítva. A lombikot forgó rázógépen (200 ford/perc) inkubáljuk, 28-30 *C-on, 92 órán át. A kapott tenyészetet ekkor egy üvegférmén tor beoltására használjuk fel, amely 4 liter, az előbbi összetételű táptalajt tartalmaz, és a tenyészetet 48 órán át 28-30 “Ck-on inkubáljuk, kevertetés közben (kb. 900 ford.T/perc) és levegőztetés mellett (kb. 1 standard liter levegő/térfogat/perc). A kapott fermentlevet átvisszük egy fermentorba, amely 501, a következő összetételű termelő táptalajt tartalmaz: keményítő 20 g/1 pepton 2,5 g/1 hidrolizált kazein 2,5 g/1 élesztőkivonat 3 g/1 szarvasmarha-kivonat 2g/l szójaliszt 2 g/1 kalcium-karbonát desztillált víz q.s. lg/1 Sterüizálás előtt pH 7,0-ra beállítva., és a tenyészetet kb. 72 órán át 28-30 ”C-on inkubáljuk. Az antibiotikum-termelést papírkorongos vizsgálattal követjük, B. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, minimális Davis-f. táptalajon. A gátlási zónákat egy éjjelen át 35 °C-on végzett inkubálás után értékeljük ki. 2. példa A GE 2270 antibiotikum kinyerése Az előbbiek szerint előállított fermentlevet (501) elkülönítjük és szűrési segédanyag (Clarcell) jelenlétében szűr jük. A GE 2270 antibiotikum főként a micéliumban fordul elő, bár bizonyos mennyiségben megtalálható a szűrletben is és kinyerhető ebből. a) A szűrlet kb. pH 7,0-ra állítjuk be és 501 etilacetáttal extraháljuk. A szerves fázist centrifugálással elkülönítjük, és csökkentett nyomáson kis térfogatra töményítjük be. A kapott olajos maradékot ezután petroléterrel kezeljük. így kicsapjuk a nyers GE 2270 antibiotikumot, amelyet szűréssel összegyűjtünk és szárítunk. 515 mg nyers GE 2270 antibiotikum komplexet kapunk. b) A micéliumot kétszer extraháljuk 20-201 metanollal és az egyesített kivonatokat csökkentett nyomáson bepároljuk. Vizes maradékot kapunk, amelyet kétszer extrahálunk etü-acetáttal. A nyers GE 2270 antibiotikumot (6,06 g) petroléter hozzáadásával csapjuk ki a betöményített szerves fázisból. 3. példa AGE 2270 antibiotikum tisztítása és az A faktor kinyerése Az előbbiekben leírt eljárással a micéliumból kapott nyers anyagot (3 g) tetrahidrofuránban oldjuk és csökkentett nyomáson (0,068-0,047 mm-es szita-lyukbőségű) szilikagél jelenlétében betöményítjük. A kapott sziláid maradékot összegyűjtjük és felvisszük egy kromatográfiás oszlopra, amely 300 g (0,068-0,047 mm-es szita-lyukbőségű) szilikagélt tartalmaz, metüén-kloridban. Az oszlopot először 2 1 metilén-kloriddal eluáljuk, majd egymás után 1,5-1,51 metilénklorid:metanol eleggyel, amelynek összetétele a következő: 98:2,; 96:4; 94:6; 92:8; 90:10 és 88:12 (térfytérf.). A rakciókat összegyűjtjük, TLC-vel, HPLC-vel vagy mikrobiológiai módszerrel (B. subtilis felhasználásával) elemezzük, és a frakciókat antibiotikumtartalmuk szerint egyesítjük. Az egyesített frakciókat, amelyek a tiszta GE 2270 antibiotikum A faktort tartalmazzák (HPLC retenciós idő 14,9 perc, 1. az előbbi e) pont szerinti f izikokémiai adatokat) csökkentett nyomáson betöményítjük. így egy olajos maradékot kapunk, amelyet tetrahidrofuránban oldunk. Ebből az oldatból petroléter hozzáadásával 600 mg GE 2270 antibiotikum A faktort csapunk ki, melynek fizikai kémiai állandói megegyeznek az előzőekben megadottakkal. 4. példa További mennyiségű GE 2270 antibiotikum A faktort kapunk a többi frakcióból, amelyet az előbbiekben leírt kromatográfiás eljárással különítettünk el, de amelyek az antibiotikumot szennyezett alakban (HPLC) tartalmazzák. Ezeket a frakciókat is összeöntjük, betöményítjük és a fenti módon kezeljük, szilárd anyag előállítására. Ezt a nyers GE 2270 antibiotikum A faktor készítményt HPLC-vel tisztítjuk, a következő eljárás szerint: E csapadék egy részét (6 mg (1:1) térfytérf.) ace-22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
