203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 HU 203 578 B 2 sékleten. Mintegy 36 ml felülúszót nyerünk ki, és 2,5 térfogat etanolt adunk hozzá, összekeverjük, és az így létrejött oldatot jégen hagyjuk 15 percen át. A plazmid DNS-t centrifugál ássál összegyűjtjük 12000 g-nál, 30 percen át, szobahőmérsékleten. A felülúszót elöntjük, a DNS üledéket 70%-os etanollal mossuk szobahőmérsékleten. Az etanolos mosóoldatot dekantáljuk, és az üledéket vákuumos szárítóban szárítjuk. Az üledéket ezután újra szuszpendáljuk 8 ml TE pufferban [10 mmól/1 trisz-HQ (pH 8,0) és Immól/IEDTA]. 8 g CsQ-t adunk a DNS oldathoz. Mintegy 0,8 ml-t adunk 10 mg/ml-es vizes etidium-bromid oldatból minden 10 ml CsQ-DNS oldathoz. Az oldat végső sűrűsége mintegy 0,761 g/ml, és az etidium-bromid koncentráció mintegy 800 pg/ml. Az oldatot átvisszük Beckman Type 50 centrifugacsőbe, tetejére TE puffer réteget helyezünk, amely 0,761 g CsCl-t tartalmaz millüiterenként, a csövet lezárjuk, és 45000 fordulat/percnél centrifugáljuk 24 órán át 20 *C hőmérsékleten. Centrifugálás után két DNS csík látható normál fénynél, ezek még szembetűnőbbek UV fényben. A fedőt eltávolítjuk a csőről és az alsó DNS csíkot kinyerjük, injekciós tűvel ellátott fecskendőt alkalmazva a centrifugacső oldalán keresztül. Az etidium-bromidot úgy távolítjuk el a plazmid DNS oldatából, hogy az oldatot többször extraháljuk vízzel telített 1-butanollal, míg a CsCl-t TE-pufferral szemben végzett dialízissel távolítjuk el. Pufferolt fenollal, majd kloroformmal végzett extrahálás után a DNS-t kicsapjuk, 70%-os etanollal mossuk, és szárítjuk. Ezzel az eljárással mintegy 0,5 mg pOJ171 plazmid DNS-t kaphatunk. A pOJ171 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábrában mutatjuk be. 2. példa A pOJ325 és pOJ325A plazmidok megalkotása A A pOJ160 plazmid izolálása A pOJ 160 plazmidot a Northern Regional Research Center-tői szerezhetjük be, E. coli K12 JM109 törzsben, NRRL B-18088 letéti számon. Az E. coli K12 JM109/pOJ160 liofilizett tenyészetét L agar lemezre helyezzük (10 g Bacto-tripton, 10 g NaCl, 5 g Bacto élesztőkivonat, és 15 g agar literenként), amely még 200 (Ag/ml apramicint is tartalmaz, ilyen módon kapjuk a törzs egyedi telep-izolátumát. Ezt a telepet alkalmazzuk mintegy 500 ml, 200 pg/ml apramicint is tartalmazó L-tápközeg inokulálására (L-agar agar nélkül), az így létrejött tenyészetet 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk levegőztetés mellett, amíg a sejtek elérik a stacionárius fázist. A sejtekből plazmid DNS-t nyerünk ki a pOJ325 plazmid megalkotásához való felhasználásra a fenti 1. példában leírt eljárással összhangban. Mintegy 0,5 mg pOJ160 plazmid DNS-t kaphatunk ezzel az eljárással. A pOJ160 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be. B.A pOJ325 plazmid végső megalkotása Mintegy 10 pg (10 pl) pOJ160 plazmid DNS-t adunk 2 pl lOxBamHI pufferhez [60 mmól/1 trisz-HQ (pH 7,9), 1,5 mól/1 NaCl, 1 mg/ml BSA, és 60 mmól/1 MgCl2], 6 pl H20-hoz és 2 pl BamHE restrikciós enzimhez [—30 egység; az egység definíciója itt annak felel meg, amelyet a New England Biolabs (32 Tozer Road, Beverly, Massachussets 01915-9990) megadott, hacsak másképpen nem jelezzük]. Az így kapott reakciókeveréket 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A BamHI-gyel emésztett pOJ16Q plazmid DNS-t úgy nyerjük ki, hogy a reakciókeverék nátriumacetát (NaAc) koncentrációját 0,30 mól/l-re állítjuk be, hozzáadunk 2,5 térfogat etanolt, a reakciókeveréket -70 ’C-ra hűtjük le, és centrifugálunk, hogy a kicsapott DNS-t üledékbe vigyük. A BamHI-gyel emésztett pOJ160 DNS üledékét újra szuszpendáljuk 400 pl TE pufferban [10 mmól/1 trisz-HQ (pH 8,0) és 1 mmól/1 EDTA], Mintegy 1 pl (0,1 egység) bakteriális alkálikus foszfatázt (International Biotechnology, Inc., P.OJBox 1565, New Haven, Connecticut 06506) adunk a DNS oldathoz, és a reakciókeveréket 65 *C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. A reakciókeveréket 400 pl fenolddoroform 1:1 keverékkel extraháljuk, majd 400 pl kloroformmal extraháljuk. A Bam- HI-gyel emésztett, defoszforilezett pOJ160 plazmid DNS-t a fentiek szerinti etanolos kicsapással és centrifugálissal összegyűjtjük, és a DNS üledéket újra szuszpendáljuk 10 pl TE pufferban. Mintegy 10 pg pOJ171 plazmidot 100 pl TE pufferban hozzáadunk 13 pl 10 x Bgin pufferhoz [1,0 mól/1 NaQ, 100 mmól/1 trisz-HQ (pH 7,4), 100 mmól/1 MgQ2,100 mmól/12-merkapto-etanol, és 1 mg/ml BSA], 13 pl H20-hoz és 4 pl (-60 egység) BglH restrikciós enzimhez. Az így létrejött reakciókeveréket 37 *C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A reakciókeveréket extraháljuk, és a DNS-t a fentiek szerint összegyűjtjük. A DNS üledéket feloldjuk 50 pl TE pufferban, ez mintegy 2,5 pg-ot tartalmaz a pOJ171 plazmid kívánt -14 kb-s BglH fragmentumából. ABamHI-gyel emésztettt, defoszforilezett pOJ160 plazmid DNS-t (1 pl) hozzáadjuk 10 pl (-0,5 pg), BglH-vel emésztett pOJ171 plazmid DNS-hez, 2 pl 10 x ligás pufferhez [660 mmól/1 trisz-HQ (pH 8); 66 mmól/1 MgQ2, 10 mmól/1 ditiotreitol (DTT), és 10 mmól/1 ATP], és 6 pl H20-hoz. Mintegy 1 pl (-100 egység) T4 DNS ligázt adunk a DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 15 ‘C hőmérsékleten egy éjszakán (-16 órán) át inkubáljuk. A ligáit DNS tartalmazza a kívánt pOJ325 plazmid DNS-t; a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és funkciós térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra mutatja be. Mivel a POJ 171 plazmid -14 kb-s, carGgént tartalmazó BglH restrikciós fragmentumot a pOJ160 plazmidba a két orientáció mindegyikébe be lehet építeni, a ligálás létrehozza a pOJ325A plazmidot is, amely a pOJ325 plazmidtól csak a carG gént tartalmazó restrikciós fragmentum orientációja tekintetében különbözik. A pOJ160 plazmid BamHI helye egy olyan polilinkeren belül helyezkedik el, amely maga a lacZ «-fragmentumot kódoló DNS szekvencia részét képezi. A 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
