203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 Hü 203 578 B 2 Alkotórész Mennyiség glükóz 10 g L-aszparagin. 1H20 2,0 g kazaminosavak 0,1 g agar 22 g víz 700ml-re A pH-t pH 7,2-re állítjuk be autoldávozás előtt. Autoldávozásután a következőket adjuk hozzá: KH2P04(0,05g/100ml) 100 ml Caa2(2,22g/100ml) 100 ml TES puffer 5,73 g/100 ml (pH 7,2) 100 ml 4. Lágy tápagar (SNA, -11) Alkotórész Mennyiség Difco Bacto Nutrient Broth 8 g Agar 5g 5. AR2YE tápközeg olyan R2 tápközeg, amelynek literéhez 20 ml 25%-os élesztőkivonatot adunk. 6. Élesztőkivonat—Malátakivonat (YEME, -11): Alkotórész Mennyiség Élesztőkivonat 3 g Pepton 5g Malátakivonat 3g Glükóz 10 g 7. YEME + 34% szacharózh folyékony teljes tápközeg az YEME 340 gd szacharózzal 8. YMX tápközeg (-11) Alkotórész Mennyiség Élesztőkivonat 3 g Malátakivonat 3g Glükóz 2g Agár 20 g 9. Az YMX agar: 0,3% élesztőkivqnat, 0,3% malátakivonat, 0,2% dextróz és 2,0% agar 10CSI tápközeg (-11) Alkotórész Mennyiség Szójaliszt 15 g Karóin lg Keményítőcukor 25 g Melasz 3g CaC03 2,5g Czapek ásványisó törzsoldat 2 ml Ionmentesített víz 1 liter pH 7,2-re beállítva sterilizálás előtt 11 Czapek ásványisó keverék (~ 11): KQ 100 g MgS04.7H20 100 g Ionmentesített víz 900 g FeS04.7H20-t (2 g) feloldunk 100 ml ionmentesített vízben, amely 2 ml koncentrált HCl-t tartalmaz. Ezt az oldatot adjuk a fenti KCl/MgS04.7H20 oldathoz, hogy teljessé tegyük a Czapek ásványisó keverék elkészítését. 12Bennet Agar (-11) Alkotórész Mennyiség Ionmentesítettvíz 1000 ml Burgonyadextrin 10g N-2aminA 2g Gibco Bacto agar 15g Gibco marhahúskivonat 2g Alkotórész Mennyiség Élesztőkivonat 1 g Czapek ásványisó törzsoldat 2 ml B, Transzformálás A pOJ171 plazmidot a pOJ325 plazmidot különkülön alkalmazzuk Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270) transzformálására lényegében a fentebb már ismertetett eljárással összhangban. Streptomyces thermotoleranst (NRRL 15270) Bennett agarra szélesztünk és 30 *C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán át. Spóra-kaparékot távolítunk el a lemezről, és felhasználjuk 10 ml TSB inokulálására [a TSB-t 30 g/l-esre készítjük, ezt a Baltimore Biological Laboratories-től (BBL) kapjuk, a P.OJBox 243, Cockeysvüle, Maryland 21031], A tenyészetet levegőn rázó inkubátorban inkubáljuk 30 *C hőmérsékleten 3 órán át. Ezt a tenyészetet homogenizáljuk és ultrahanggal kezeljük; ezután 3 ml tenyészetet alkalmazunk 17 ml, 0,4% glicint tartalmazó TSB inokulálására. A tenyészetet levegőn rázó inkubátorban inkubáljuk 30 ‘C hőmérsékleten mintegy 24 órán át Ezt a tenyészetet ismét homogenizáljuk és ultrahanggal kezeljük, ezután 3 ml tenyészetet alkalmazunk 17 ml 0,4% glicint tartalmazó TSB inokulálására. A tenyészetet ismét homogenizáljuk és ultrahanggal kezeljük, majd a micelizális fragmentumokat centrifugálással kinyerjük és kétszer mossuk 10,3%-os szacharóz oldattal. A miceliális fragmentumokat újra szuszpendáljuk 20 ml P-tápközegben (3A1 példa), amely 1 mg/ml lizozimot is tartalmaz, és az így létrejött oldatot szobahőmérsékleten inkubáljuk mintegy 1- 1,5 órán át. Ennek a protoplasztképzési lépésnek a során a sejteket fel-le pipettázzuk, hogy a csomókat eloszlassuk. A protoplasztokat összegyűjtjük és kétszer mossuk P tápközeggel. A protoplasztokat ezután 2 ml P tápközegben szuszpendáljuk. Ez az eljárás általában 2-5.107 protoplasztot alkit ki 200 pl oldatra számítva. Mintegy 200 pl protoplaszt oldatot alkalmazunk a transzformációhoz. Mintegy 1 pg transzformáló DNS-t, 10 pl ligáló, vagy TE pufferban oldva, adunk 50 pl 1 mg/ml-es heparin-oldathoz (Sigma Chemical Co., P.OJBox 14508, St. Louis, Missouri 63178). és összekeverjük. ADNS oldatot hozzáadjuk protoplasztokhoz; ezután mintegy 0,9 ml, P-tápkörógben levő 55%-os polietüénglikol 1000-t (Sigma) adunk hozzá és összekeverjük a protoplasztokkal. A sejt-DNS keveréket Vortex berendezésen keverjük, majd R2 tápközegre (3A3. példa) szélesztjük, minden lemezt mintegy 0,1 ml, -3 ml R2 módosított lágy agarral [103 g szacharóz, 0,5% agar, 10,12 g MgQ2, 2,22 g CaC^ és 5,72 g TES (pH 7,2) literenként] kevert sejttel inokulálunk. A lemezeket 30 'C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán (-16 órán) át, majd felülrétegezzük -3 ml R2-módosított lágy agarral, amely annyi apramicint tartalmaz, hogy diffúzió után végső koncentrációja 25 pg/ml legyen. A lemezeket azután mintegy 4 napon át inkubáljuk 30 *C hőmérsékleten, amikor a telepek láthatóvá válnak szabad szemmel. 5 10 15 20 25 30 36 40 45 50 55 60 11
