203577. lajstromszámú szabadalom • Delta-endotoxint tartalmazó inszekticid készítmények és eljárás inszekticid hatású delta-endotoxin előállítására
1 HU 203 577 B 2 tenyészetről, és a lombik tartalmát 300 fordulat/perc sebességű keverés közben 30 'C-on inkubáltuk. 24 óra elteltével a 100 ml térfogatú inokulummal 2 liter űrtartalmú lombikba töltött 1 liter, a fentivel azonos összetételű közeget oltottunk be, és a lombik tartalmát 300 fordulat/perc sebességű keverés közben 5 napig 30 'C-on inkubáltuk. Ugyanígy tenyésztettük az A29 törzset is. 4. példa Inszekúcid készítmény előállítása A fermentációs ciklus végén centrifugálással vagy mikroszűréssel elkülönítettük a Bacillus thuringiensis A20 törzs spóráit és a kristályokat a fermentlétól. A kapott spórákat és kristályokat (tömegük: 1,3 g) 100 ml vízben újra szuszpendáltuk, és a szuszpenzióhoz egymás után, a megadott sorrendben 4,9 g Morwet D- 425-öt (diszpergálószer), 4,9 g Veegum HV-t (szuszpendálószer), 4,9 ml Tween 80-at (nedvesítőszer) és 24,4 ml Sorbo-t (fagyásgátló anyag) adtunk. Felhasználás előtt az így kapott folyékony koncentrátumot 40 ‘C-on tároltuk. A fentivel azonos összetételű készítményt állítottunk elő az A29, illetve HD-1 jelű törzs fermentációjával kapott anyagból is; az utóbbit összehasonlító anyagként használtuk. 5. példa A Bacillus thuringiensis A20 és A29 törzs vizsgálata növények rovarkártevők elleni védelmében A 4. példa szerint előállított készítmények inszekticid hatását Choristoneura fumiferana-val szemben vizsgáltuk. Fenyőfák ágait a rovar 4-5. fejlődési stádiumban levő lárváival fertőztük meg, majd az ágakat MRY-2 típusú permetezőberendezés (gyártja a Hartwig Jensen Co., Dánia) segítségével bepermeteztük a vizsgálandó készítménnyel. AzA20 és HD-1 törzs esetében a permetlé cseppjeinek átmérője 20-120 pm, átlagosan 32 pm, míg az A29 törzs esetében a permetlé cseppjeinek átmérője 20-60 p, átlagosan 30 p volt. Mindhárom esetben egy tűlevélre átlagosan 11 cseppet vittünk fel; mindhárom törzset 30 x 109 NE/hektár koncentrációban permeteztük a kezelendő felületre. A készítmények hatóanyagtartalma 9 tömeg/térfogat% volt. A kezelt ágakat a rovarok beábozódásáig termesztőtérben tároltuk, és ezután meghatároztuk a rovarok pusztulási %-át [(elpusztult rovarok száma/elpusztult és élő rovarok száma) x 100.] Az eredményeket az 5. táblázatban közöljük. 5. táblázat Törzs Pusztulási % Aktivitási arány* HD-1 47 1,7 A20 60 8,7 A29 65 6,0 'Pusztulási V a készítményben lévé Bacillus thuringiensis-pír, g Ebben a vizsgálatban - az aktivitási arány alapján - az A20 törzs felhasználásával kapott készítmény 5,1 -szer, míg az A29 törzs felhasználásval kapott készítmény 3,53-szor hatásosabb volt a HD-1 törzs felhasználásával kapott készítménynél. 6. példa A készítmények inszekticid hatásának vizsgálata A 3. példában közölt ötnapos inkubálás után a fermentléből centrifugálással elkülönítettük a sejteket, spórákat és kristályokat, majd acetonnal kicsaptuk. A kapott port a vizsgálandó rovarok számára készített mesterséges táplálékba kevertük be, majd a rovarokat fogyasztani hagytuk a táplálékból, és Ismert módon meghatároztuk a pusztulási arányt. Az eredményeket a 6. táblázatban közöljük. 6. táblázat Rovar Törzs LC50* Aktivitásnövekedés** Trichoplusia ni A20 0.9 6,3 (4 napos lárva) A29 2,9 1,97 HD-1 5.7 1 Plutellaxylostelle A20 0,43 9,3 (4 napos lárva) A29 1,78 2,24 HD-1 4,00 1 Heliothiszea A20 19,7 2,7 (1. fejlettségi állapotú lárva) A29 27,6 1,92 HD-1 52,9 1 ♦szilárd anyag, pg/1 ml táplálék ** LC50 (A20) vagy (A29): LC50 (HD-1) A rovarok mesterséges táplálékát a következőképpen állítottuk elő: 20 literes edénybe 12 liter ionmentes vizet töltöttünk, és a vizet 50 ‘C-ra melegítettük. A vízhez állandó keverés közben, 50 "C-on 69,2 ml búzacsíra-olaj és 426,9 ml nátrium-kazeinát előre elkészített keverékét adtuk, majd a keverést és a melegítést folytatva beadagoltuk 46,2 g alfacel, 46,2 g L-aszkorbinsav, 24,4 g szorbinsav, 11,5 g kolin-klorid, 553,8 g búzacsíra, 103.8 g Wesson-sókeverék, 16,1 g metü-parabén és 426.9 g szacharóz keverékét. Az elegyet állandó keverés közben 65 *C-ra melegítettük, és ezen a hőmérsékleten 213,5 g agart adtunk hozzá. A kapott elegyet 15 percig 120 ‘C-on, 105 atmoszféra nyomáson sterilizáltuk, majd 60-65 *C-ra hűtöttük, és 40,4 ml A-vitamin oldat és 40,4 ml B-vitamin oldat előre elkészített keverékét adtuk hozzá. Az elegyet legalább 5 percig erélyesen kevertük, majd beadagoltuk a 6. táblázatban feltüntetett mennyiségű szüárd hatóanyagot. A mesterséges táplálék készítéséhez felhasznált A- vitamin oldat 0,75 g folsavat és 1,50 g riboflavint tartalmazott 250 ml steril ionmentes vízben oldva. A B- vitamin oldat 60,00 mg biotint, 6,00 mg cianokobalamint, 0,75 g tiamin-hidrokloridot, 0,75 g piridoxinhidrokloridot, 3,00 g niacin-amidot és 3,00 g kalciumpantotenátot tartalmazott 250 ml steril ionmentes vízben oldva. 5 10 16 20 25 30 36 40 45 50 55 60 5
