203552. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oxetanocin-származékok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 HU 203 552 B 2 Vegyület száma Koncentráció (pg/ml) Sejt denaturálás Vírus antigén kifejlesztése (%) 100 ++ <0,1 8 10 3 3-5 100 +++ <0,1 9 10 + 3 3 ± 7 100 + <0,1 10 10-50 3->90 100 ± <0,1 11 10-75 3->90 100 + <0,1 13 10-<0,1 3-<0,1 100 ± <0,1 16 10-6 3-17 100 ± <0,1 17 10-10 3-60 Avizsgált hatóanyagot dimetil-szulfoxidban felvett oldat formájában alkalmazzuk. A tiszta dimetü-szul- 30 foxiddal végzett vizsgálat során a vírus antigén kifejlődése 80-90%. Anti-citomegalovírus hatás vizsgálata Az anti-citomegalovírus hatás vizsgálatát az alábbi 35 módon végezzük. Humán magzati fibroblaszttal bevont 33 mm átmérőjű lemezt 100 PFU (plaque forming unit) cito-megalovírussal (AO 169 törzs) fertőzünk. Egyórás adszorpció után különböző koncentrációjú vizsgált hatóanyagot tartalmazó közeggel 40 (0,5 tömeg% agaróz, 2 tömeg% borjú magzati szérum) fedjük le és az egész tenyészetet 10 napon keresztül 37 °C hőmérsékletű és 5 tömeg% széndioxidos inkubátorban tartjuk, majd a foltképződést mérjük. A mérési eredményeket az 50%-os gátló hatás (IC50) értékben 45 kifejezve a 3. táblázatban adjuk meg. 3. táblázat Vegyület száma IC50(pg/ml) 9. 1,7 14. >5 15. >5 Hepatitisz B vírus gátló hatás vizsgálata Aktív hepatitisz B vírust termelő HB 611 májsejteket [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,444 (1987)] Dulbecco módszere szerint módosított Eagle közegben (GIBCO) 10 tömeg% borjú magzati szérum, 200 pg/ml 50 55 60 G418,100 pg/ml penicillin és 100 pg/ml sztreptomi«. cin jelenlétében 5 tömeg% széndioxid atmoszférában r 37 °C hőmérsékleten tenyésztünk. 5 x 104 sejt/minta .. mennyiségben hat felviteli helyet tartalmazó lemezre(35 mm átmérő) inokuláljuk. 1-2 nap után 50%-os összefolyást érünk el, és ekkor adott mennyiségű vizsgált hatóanyagot adunk a tenyészethez. A tenyészközeget 3 naponként friss közegre cserélve a tenyésztést. 15 napon keresztül folytatjuk. Ezután a tenyészközeget eltávolítjuk és a sejteket 37 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül 0,5 ml lysis pufferrel (10 mmól/1 Tris- HC1, pH=7,8, 5 mmól/1 Na2EDTA, 1 tömeg% SDS és 0,1 mg/ml Pronase K) kezeljük. Az oldatban kapott DNS-t RN-áz kezeléssel, fenolkloroform kezeléssel és etanolos kicsapásos módszerrel tisztítjuk. 5 mikrogramm DNS-t HindlH-mal kezelünk és a DNS mintákat Southem-féle folt-analízissel 32P jelölésű hepatitisz B vírus DNS mintával szemben analizáljuk A mérési eredményeket a 4. táblázat tartalmazza. 4. táblázat Vegyület száma Koncentráció (jxg/ml) Vírus DNS-szintézist gátló hatás Citotoxieitás 50 + ++ ++ 3 10 ++-2 +-7
