203405. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Digitalis-levelek előkezelésére
5 HU 203 405 B 6 elkülönítjük. A fehérje teljes denaturálódását igazolja, ha a felülúszóban nincs oldható fehéije. Ennek kimutatására a felülúszóhoz 5%-os végkoncentrációban triklór-ecetsavat, illetve perklórsavat adunk. A hagyományosan előkészített mintáknál nagy mennyiségű csapadék válik ki, a találmány szerint kezelt mintáknál a felülúszó frakció gyakorlatilag nem tartalmaz kicsapható fehérjét. A hagyományosan előkészített mintánál kicsapás után a peptidkötésre jellemző 225 nm-nél mért abszorpció értéke megegyezik a találmány szerint kezelt minta kicsapás előtti - és természetesen utáni - 225 nmnél mért abszorpció-értékkel. (Az oldható fehérje-frakciókat a meghatározás előtt dializáltuk.) IV. Az enzim-aktivitás közvetlen kimutatása a) Mind a hagyományos úton, mind a találmány szerint kezelt mintákból 5%-os szárazanyagtartalmú homogenizátum-mintákat készítünk, s a mintákat dializáljuk,- hogy a kimutathatóság határa alá csökkentsük a minták „saját-glikozid” tartalmát. így lehetővé válik, hogy a mintákhoz adott lanatozid C-ből keletkező acetildigoxin-, illetve digoxin-tartalmat pontosabban meghatározzuk. A hagyományos úton és a találmány szerint kezelt minták 2 ml-nyi homogenizátumához lanatozid C-t adunk 0,5 mg/ml végkoncentrációban és szobahőmérsékleten (kb. 25 *C) különböző ideig inkubáljuk. Az 1 órai, 1 napi, 1 heti inkubálás eredményét, a glikozidarány változását a 2. táblázat mutatja. Látható, hogy a hagyományosan előkészített mintáknál már egynapos inkubáció után a primer-glikozid mintegy 65-75%-a átalakul szekunder glikoziddá, 15-25%-nál végbement a deacetileződés is. Egyhetes inkubáció után a szekunder glikozid aránya már több mint 90%-os. Ezzel szemben a találmány szerint kezelt mintáknál még egyhetes inkubálás után sem tapasztaltunk kimutatható átalakulást, ami az elemzési módszer pontosságát tekintve azt jelenti, hogy még 0,3%-nyi átalakulás sem történt b) A frissen szedett levelek harmadik halmazából vett mintákat különböző ideig besugározzuk a már említeti mikrohullámú készülékben (1.1. példa I. pontját), mégpedig az eltérő (időtartamú) sugáradagok mindegyikével olyan mintákat is besugárzunk, melyeket a levelek szabadon behelyezett halmaza alkot s olyanokat is, melyeknél az adagot lezárt műanyagfólia-tasakban helyezzük a munkatérbe. Szabad halmazként illetve műanyagfólia-tasakban különböző ideig besugárzott minták 2 ml-nyi homogenizátumát szobahőmérsékleten (kb. 25'Q lanatozid-C- vel 20 óráig inkubáljuk. A 20 órai inkubálás után kivett mintáknál meghatározzuk - és az ábrán bejelöljük - a sugáradag, vagyis a besugárzási időtartam függvényében a kezelés utáni víztartalmat (háromszögletű pontok) és az átalakult lanatozid-C %-os mennyiségét (kerek pontok) és a pontok mentén rajzoljuk a megfelelő jelleggörbéket Az a-jelleggöibék mutatják, hogy a szabad halmazként besugárzott mintáknál egyfelől a víztartalom csökkenése, másfelől a denaturál ódás mintegy párhuzamosan, hasonló menettel végbemenő folyamatok; a láncok átalakulása kb. ugyanakkor konvergál a nullához, amikor a víztartalom. A b-jelleggörbéken látható, hogy légmentesen lezárt adag besugárzása során a víztartalom kisebb mértékű csökkenése mellett (pl. amikor a víztartalom még mindig 65-70%-os) meredek eséssel gyakorlatilag megszűnik a szekundereződési folyamat; mintegy egy percnyi besugárzás után kapott mintánál a homogenizátumhoz adott lanatozid-C-tartalom az inkubáció során teljes mértékben változatlan marad. 2. táblázat A primer-glikozidlanatozid- acedldigoxin dal együtt inkubált Inkub.-digoxin minta tartam [és] összglikozid hányadosa [%] Hagyományos 1 óra 100 0 0 Digitális-levél 1 mg) 30 ± 5 50 ± 5 20± 5 1 hét 0 20± 5 80± 5 Találmány szerinti, 1 óra 100 0 0 előkezelt fólium 1 nap 100 0 0 1 hét 100 0 0 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás digitálisz primer glikozidok előállításához gyűjtött Digitális-levelek előkezelésére, azzal jellemezve, hogy a begyűjtött növényi levelet mikrohullámú energiaforrással csatolt munkatérbe, előnyösen magnetron üregébe helyezzük és 0,5-10, előnyösen 1-6 percen át 0,5-5,0 g Herz hullámhosszon, 0,5-2,0 kW teljesítmény mellett 20 *C és a víz forráspontja közötti hőmérsékleten besugározzuk, kívánt esetben a kezelt növényi levelet szabad levegőn, vagy zárt térben a környezet hőmérsékletén továbbszárítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a növényi levéladagot légmentesen lezárt műanyagfólia-tasakban helyezzük a munkatérbe. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a mikrohullámú besugárzást a növényi levél begyűjtésének helyén - a növényi levél szárítására alkalmazott jármű tartozékaként kialakított mirkohullámú készülék alkalmazásával - hajtjuk végre, egymást követően külön adagokat helyezve a munkatérbe vagy a növényi levéladagokat - a munkatéren áthaladó szállítópálya alkalmazásával - folyamatosan bocsátjuk át a munkatéren. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4
