203371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új inzulin-származékok és az azokat tartalmazó injekciós oldatok előállítására
7 HU 203 371 B 8 Az (I) általános képletben és a jelen leírásban máshol is, az A(l-3) jelentése Gly-Ile-Val, és az A(5-6) jelentése Gln-Cys stb., lásd a humán inzulin aminosav-szekvenciáját. A jelen leírásban inzulinon általában humán inzulint értünk, az ettől való eltéréseket külön megadjuk. Az inzulin-származékok előállítása Az inzulin forrása egy élesztőben kifejezett inzulin prekurzor, amelyet a 163 529 számú közzétett európai szabadalmi leírás ismertet Az inzulin prekurzort a tenyészetből LiChroprepTM RP-18 abszorbensre kötjük meg, amint ezt az említett európai szabadalmi leírás 7. példája leírja. A prekurzorokat 0,2 mól kálium-klorid és 0,001 mól sósav 33 térfogat%-os ctanollal készült oldatával eluáljuk az oszlopról. Az inzulin prekurzorokat úgy kristályosítjuk ki az egyesített elutumból, hogy egymás után vizet (az egyesített elutum térfogatával azonos térfogatban), ezután 0. 05 mólos koncentrációig szilárd trinátrium-citrátot, és végül 0,006 mólos koncentrációig cink-acetátot adunk hozzá. Az elegy pH-ját 6,8-ra állítjuk, és az egész elegyet éjszakán át 4 *C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kivált kristályokat lecentrifugáljuk, vízzel mossuk és csökkentett nyomáson megszárítjuk. Az enzimes félszintézis céljaira a védett aminosavakat és védett peptidcket a szokásos, önmagában ismert módszerekkel állítjuk elő, vagy vásároljuk a Nova Biochem vagy Bachem cégektől (mindkettő svájci). A TM jelzés egy név után arra utal, hogy az adott név védjegyezve van. Az 1-14. példában alkalmazott kiindulási (II) általános képlett! vegyületben a (Q,-T)r részlet Ala-Ala-Lys, és ezt a pMT610 jelzésű élesztő-plazmidra ugyanúgy építjük ki, amint ezt a 163 529 számú közzétett európai szabadalmi leírás 10. példája leírja. A Gin813, GlnAl7, Arg827, Lys827, Asp"1, Gly"1, His"1, Ser"1 és Thr"1 am inosavakat kódoló nukleotidokat a pMT610 plazmidba helyspecifikus mutagenezissel visszük be, a leírt módon: Nucl. Acids. Res., 11,5103-5112 (1983). A találmány szerinti eljárást a továbbiakban - a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül - példákkal szemléltetjük. 1. példa A Gin?13, Arg827 humán inzulin előállítása 5 g GlnB13,ArgB273(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) inzulin prekurzor 50 ml 2 mólos, dimetil-formamiddal készült L-treonin-tercier-butil-észter-hidroacetát-oldattal készült szuszpenziójához hozzáadjuk víz és dimetil-formamid olyan elegyének 25 ml térfogatú részletét, amely elegyet úgy készítünk, hogy 25,5 ml vizet dimetü-formamiddal 100 ml végső térfogatra töltünk fel. A szuszpenziót keverés közben 12 "C hőmérsékletre hűtjük. Utána hozzáadjuk 0,5 g sertés tripszin 12,5 ml 0,05 mólos, vizes kalcium-acetát-oldattal készült oldatát A reakcióelegyet az oldatlan részek feloldódásáig keverjük. Az elegyet 48 órán át 12 "C hőmérsékleten tartjuk, majd a fehérjék kicsapása céljából az elegyet 600 ml acetonba öntjük. A csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük, egyszer 200 ml acetonnal mossuk, újra lecentrifugáljuk, és nitrogén áramban megszárítjuk. Az így kapott csapadékot feloldjuk 100 ml 0,04 normál sósavban, az elegy pH-ját 2,5-re állítjuk, és az oldatot felvisszük egy 5 x 30 cm méretű, preparatív nagyfelbontású folyadék-kromatorgáfiás oszlopra. Az oszlop állófázisa oktadecil-dimetil-szilil-csoportokat viselő szilikagél, átlagos részecskemérete 15 mikron, pórusmérete 100 Á. Az oszlopot etanol és kálium-kloridra nézve 0,3 mólos, és sósavra nézve 0,001 normál vizes oldat 35,5 : 64,5 térfogatarányú elegyével egyensúlyba hozzuk, majd a fehérjéket ugyanezzel a puffer-oldattal, óránként 21 sebességgel eluáljuk az oszlopról. A GlnB13,ArgB27,'Ihr830-OBut humán inzulin 55 és 100 perc közötti eluciós idővel jön le az oszlopról. A GlnB13,ArgB27,Thr830-OBu< humán inzulint az egyesített frakciókból úgy különítjük el, hogy az elutumhoz először 15 térfogati etanol koncentrációig vizet adunk, utána a citrátra nézve 0,05 mólos koncentrációig szilárd trinátrium-citrátot adagolunk hozzá, és végül cinkre nézve 0,006 mólos koncentrációig szilárd cink-kloridot adagolunk az elegyhez. Ezután az elegy pH-ját 6,8-ra állítjuk, 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd hagyjuk a terméket 24 órán át, keverés közben, 4 *C hőmérsékleten kikristályosodni. Ezután a kivált kristályokat lecentrifugáljuk, kétszer 20 ml jéghideg vízzel mossuk, lecentrifugáljuk és csökkentett nyomáson megszárítjuk. Dy módon 2,51 g GlnB13,ArgB27,ThrJ,30-OBut humán inzulint kapunk. A Gln^.Ajg^.Thr^-OBu* humán inzulint feloldjuk 100 ml trifluor-ecetsavban, és az oldatot 2 (kán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a trifluor-ecetsavat fagyasztva szárítással eltávolítjuk. A fagyasztva szárított anyagot feloldjuk 100 ml vízben, az oldat pH-ját 2,5-re állítjuk, és hozzáadunk 20 g nátrium-kloridot. Az oldatlan részeket, amelyek a Gin813, Arg827 humán inzulint tartalmazzák, centrifugálás útján elkülönítjük. Az így kapott szilárd anyagot feloldjuk 850 ml vízben, és a GlnB13,ArgB27 humán inzulint úgy kristályosítjuk ki, hogy az oldathoz hozzáadunk először 150 ml etanolt, utána 14,7 g trinátrium-citrát-dihidrátot, és 0,82 cink-kloridot, majd az elegy pH-ját 6,8-ra állítjuk. Ezután az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd a kristályosítást úgy folytatjuk, hogy az elegyet 24 órán át lassú keverés mellett 4 *C hőmérsékleten tartjuk. Ezt követően a kivált kristályokat lecentrifugáljuk, kétszer 20 ml jéghideg vízzel mossuk, ismét lecentrifugáljuk, és csökkentett nyomáson megszárítjuk. Ily módon 1,71 g GlnB13,ArgB27 humán inzulint kapunk, ez a mennyiség 36%-os hozamnak felel meg. A kapott termék aminosav-összetétele megfelel az elméletileg vártnak, a termék molekulánként két arginin-egységet tartalmaz. Ezt a terméket DISC PAGE (korong) elektroforézissel vizsgálva tisztának mutatkozik, a migrációs sebessége a humán inzulinénak 55%-a, annak megfelelően, hogy körülbelül két töltéssel tér el a humán inzulintól. A DISC PAGE elektroforézissel kapcsolatban lásd Horm. Metab. Res. Supplement Series No. 5, 134 (1974). A kristályos termék cink-tartalma 0,42 súly%. 2-6. példa A Gin?13 Arg?27 humán inzulin, Gin?17Arg827 humán inzulin, Arg827 humán inzulin, Lys?27 humán inzulin, és His*21 Arg?27 humán inzulin.előállítása A cím szerinti öt vegyületet az 1. példában leüt módszerrel, a megfelelő, egyetlen láncból álló inzulin prekurzorokból, vagyis a GlnBI3,GlnA17,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-ből, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
