203321. lajstromszámú szabadalom • Eljárás difenil-szulfid-származékok és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 203321 B táblázat). Ezek a kísérletek arra engednek következtetni, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek fokozzák a gazdaszervezet idegen proteinekre — például a tumorsejtek felületén kifejeződött proteinekre — adott válaszát. 5 A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek lényegében a rekombináns GS-faktorokkal azonos módon gyorsítják a csontvelő-sejtek felépülését is (1-3. ábra). A fenti vegyületek radioprotektív hatással is rendelkeznek, amint az az endogén 10 CFU-S vizsgálatból látható (VI. táblázat). A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek immunmodulátor aktivitását az alább ismertetett módszerekkel bizonyítjuk. 15 Anyagok és módszerek Kísérleti állatok, tumorok és reagensek A C57BL/6 (B16, H-2b), DBA/2 (D2, H-2d), Balb/c (H-2d) BDF1 (H-2d) és CD2F1 (H-2d) egereket a Cumberland View Farms (Clinton, TN, USA) 20 szállította. A C3H/HeJ (C3H, H-2k) egereket a Jackson Laboratories-tól (Bar Harbor ME, USA) szereztük be. A használt kísérleti állatok mint 6-10 hetesek voltak. A P815 masztocisztomát szingenikus gazdaszer- 25 vezetében tartottuk fenn. A citotoxicitási vizsgálatokhoz célsejtként a megfelelő tumorsejteket használtuk. A CTLL-2 jelölésű interleukin-2- (IL-2)dependens sejtvonalat patkány IL-2 jelenlétében, szövettenyészetben tartottuk fenn. 30 A Hank-féle egyensúlyi sóoldatot (HBSS), RPMI 1640 tápközeget, lószérumot, magzati borjúszérumot (FCS), L-glutamint, penicillint, sztreptomicint, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldatot (DPSB), és N-2-(hidroxi-etil)-piperazin-N’-2-etán- 35 szulfonsavat (HEPES) a Grand Island Biological Company-tól (Grand Island, NY, USA) szereztük be. A gentamicint az Upjohn Co.-tól (Kalamazoo, MI, USA) szereztük be, a tioglikolát közeget és a lipopoliszacharidot (LPS, E. coli 0128:B12) a Difco 40 Laboratories-tól (Detroit, Mi.) vettük. Az 5lCr-nátrium-kromát (5ICr, specifikus aktivitás: 300- 500 Ci/g) és a metil-H-timidin (3HTdR, specifikus aktivitás: 20 Ci/mmól) a New England Nuclear (Boston, MA, USA) terméke. 45 7 I. Tumorölő hatású makrofágok aktiválása Egér makrofágok előállítása Az egereknek intraperitoneálisan 1 ml tioglikolát közeget injektálunk és 4-5 nap múlva összegyűjtjük a peritoneális váladék (PE) sejteket úgy, hogy az egerek peritoneális üregét 10 egység/ml heparint tartalmazó HBSS-sel mossuk. A PE sejteket HBSS-sel háromszor mossuk és 10% FCS-t, 100 egység/ml penicillint, 100 jxg/ml gentamicint, 2 mmól/1 L-glutamint és 10 mmól/1 HEPES-t tartalmazó HBSS-ben szuszpendál juk. A sejteket 96 lyukas lemez (Costar, Cambridge, MA, USA) laposfenekű lyukaiba visszük, és 37 ”C-on 2 órán keresztül inkubáljuk. A nem tapadó PE sejteket HBSS-sel többszöri és erőteljes mosással eltávolítjuk. A viszszamaradt. tapadó sejtek többséé (95%) morfológiailag makrofágokra emlékeztet, ésMac-1 felületi antogénnel rendelkezik, amint azt fluoreszcens festéssel kimutattuk. Ezek a sejtek funkcionálisan is aktívak, latex-részecskék bekebelezésében. Makrofág-mediálta tumor citosztázis vizsgálata A D2 egerekből származó P815 tumorsejteket HBSS-sel kétszer mossuk, és 10% FCS-t tartalmazó komplett tápközegben szuszpendál juk, A B6 makrofágokat tartalmazó lyukakba 5xl03 P815 sejtet mérünk, és meghatározzuk az E:T arányt a lyukakba eredetileg bemért PE sejtek számából. A lemezeket — hacsak azt másként nem említjük — 2 napon keresztül inkubáljuk. A célsejteket minden egyes lyukban 0,5 Ci ^HTdR-rel jelezzük a vizsgálat utolsó 4 órájában, és a sejteket összegyűjtjük. A célsejtekbe beépült 3HTdR mennyiségét folyadékszcintillációs számlálóval határozzuk meg. Az átlagos cpm-et három párhuzamos tenyészetből számítjuk ki és az eredményeket %-os citosztázisként adjuk meg, amelyet az alábbi képlet segítségével számolunk ki: %-os citosztázis = (A-B)/Axl00, ahol A a normál, kontroll makrofágokat tartalmazó tenyészetek cpm-jét (beütés/perc), B a vizsgált vegyülettel kezelt egerekből nyert kísérleti makrofágokat tartalmazó tenyészetek cpmjét jelenti. 8 I. táblázat: Tumorölő hatású makrofágok aktivitása Vegyület Aktiválás (%) 1* 2** 3** 4** 5** 6** N\N”’-[szulfonil-bisz(p-fenilén)]-bisz-[N,N-dietil-butiramidin] 59,5 39,9 44,2 39,3 58,1 55,8 N’,N”’-[szulfonil-bisz(p-fenilén]-bisz[N,N-dimetil-propionamidin] 58,5 15,8 0 25,1 N.V. N.V. bisz{4-[(l-metil-2-pirrolidinil)-imino]-fenü}-szulfon 13,4 21,5 10,0 29,4 N.V. N.V. N’-{4-[(4-fluor-fenil)-szulfonil]-fenü}-N-N-dimetil-propionamidin--mono(hidrogén-klorid) N.V. N.V. N.V. N.V. 58,5 N.V. 5
