203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 molekulasúlyuk valószínűleg 19000. Az anioncserélő oszlop maximális kapacitása a ,3iD2D3D4” hibrid interferonra mintegy 5 mg. Azonos módon tisztíthatok a következő hibrid interferonok is: ,JBiD2B3B4”, „BjDjB^Da”, 5 >*®jD2D3B4”, ,31B2B3D4” és „B1B2D3B4”. 27. példa A hibrid interferon liofüizálása A ,3iD2D3D4” interferont, akár immunaf- 10 finitáskromatográfiával - a 144 BS monoklonális antitestet használva akár a konvencionális kromatográfiás eljárásokkal (26. példa) tisztítottuk, 0,5 M H4HC03 oldattal szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk. A liofilizált mintához kis mennyiségű vizet adunk 15 kétszer, hogy az NH4HC03-ot teljesen eltávolíthassuk. Az oldatot ezután újra liofilizáljuk. A ,3iD2D3D4” interferon visszaoldása a következőképpen történik: annyi 0,5 M NH4HC03 oldatot (pH=8,2) adunk a liofilizált anyaghoz, hogy interferon koncentrációja körülbelül 0,1 mg/ml legyen. A visszaoldott interferon vírusellenes aktivitása 2-108 NE/ml volt, amely megegyezik a liofüizálás előtti értékkel. 28. példa A hibrid interferonok fiziko-kémiai jellemzői A találmány szerinti hibrid interferonokat és az eredeti interferonokat SDS-PAGE vizsgálatnak vetjük alá Laemmli módszere [Nature, 227, 680 (1970)] szerint. A hibrid interferonok feltételezett molekulatömegeit a 7. táblázatban foglaljuk össze (küo-daltonban =KD). A 7. táblázat a hibrid interferonok izoelektromos pontját (pl) is feltünteti, melyet Ampholine tartalmú LKB poliakrilamid gélben határoztunk meg. 7. táblázat A hibrid interferonok valószínű molekulatömege és izoelektromos pontja IFN Valószínű molekulasúly Pl a-2 27,000 5,2 a-3 20,000 5,2 27,000 5-6 (diffúz) „DjD2B3B4” 20,000 5,0 ,3iB2B3D4” 27,000 5,2 ,31B2D3B4” 26,000 5-6 (diffúz) ,3iD2D3D4” 19,000 5,4 „BjD2B3D4” 20,000 5,6 ,3jD2^3®4” 20,000 5,5 ,31D2B3B4” 20,000 5,4 A találmány szerinti hibrid interferonok aminosav 40 szekvenciáját részben az Applied Biosystems 470 A típusú protein szekvenáló készülékével határoztuk meg. vagy a Beckman 890 C szekvenálót használtuk. Mindkét esetben automatikus Edman-degradációt végeztünk. A talált szerkezet teljesen megegyezett a várttal. Az N-terminális aminosav a cisztein. 29. példa A hibrid interferonok hatása a (2'-5’)oligo-izociaadeniát-szintetáz aktivitás szintre Daudi sejtekben Daudi sejteket oltunk 2-105 sejt/ml sűrűségben RPMI 1640 táptalajba, mely 10% fetalis borjúszérumot tartalmaz és a ,31B2B3D4”, ,3iD2B3B4”, ,3iD2D3D4” és ,3iB2D3B4” hibrid interferonokat a 8. táblázatban megadott koncentrációkban, 24 óra 55 múlva az 5-106 sejtet tartalmazó mintákat lecentrifugáljuk (9000 ford/perc), s a sejteket 500 pl hideg lizáló puff erben [20 mM 4-(2-hidroxi-etü)-l-piperazinetán-szulfonsav-puffer (pH =7,5) 5 mM MgG2, 120 mM KC1,7 mM DTT, 10% glicerin, 0,5% Nonidet 60-P40] reszuszpendáljuk és 2 percig jégen inkubáljuk. A mintákat ezután újra centrifugáljuk (9000 ford/perc; 8 perc; 4 °C), a felülúszókat leöntjük és (2’-5’)-oligoizoadenüát-szintetáz aktivitásukat a következőképpen határozzuk meg: A felülúszókhoz 50 pl po- 45 li(rl).(rc) agarózt (P-L Biochemicals) keverünk 30 °C- on, majd 15 perc múlva a nem adszorbeált anyagot centrifugálással távolítjuk el. A poli(rI).(rc)-re adszorbeálódott anyagot 2,5 mM a-29 * * 32P-ATP-vel (400 Ci/mmól; Ammersham International) inkubáljuk 50 20 órán át 30 °C-on, bakteriális alkalikus foszfatázzal (Sigma) kezeljük, majd a savanyú alumínium-oxid (300 pl acid alumina, Sigma) oszlopról 3,0 ml 1 M glicin J1Q pufferrel (pH=2,0) eluáljuk Merlin és munkatársai szerint [Analyt3iochms„ 110,190 (1981)]. A 8. táblázatban közölt adatok azt fejezik ki, hogy hányszorosára nőtt a (2’-5’)-oligo-izoadenüát-szintetáz aktivitás az interferonnal kezelt sejtekben a kezeletlen, kontroll sejtek enzim-aktivitás szintjéhez (átlagaktivitás: 51,6 ± 8,7 pmól/hr/105 sejt) képest. 26
