203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 Az 5. táblázatból az a tény szűrhető le, hogy minden egyes IFNa szubtípus epitóp kombinációja egyedi. Ezenkívül ennek a vizsgálatnak az alapján előre meg lehet mondani, hogy melyik a megfelelő párja a MAbeknek a specifikus IFNa szubtípusok meghatározásánál a tandem immunassay-ben, más szubtípusok kizárásával. Például a 144BSMAb-nekazNK2,S-3,IY-l vagy 1/24 MAb bármelyikével való kombinációja alkalmas lesz az IFNaB kimutatásánál anélkül, hogy az IFNaD-vel interferálna és a 144 BS MAb-nek a YOK MAb-el való kombinációja az IFNaD kimutatására lesz használható IFNaB jelenlétében. 21. példa Immunadszorbens oszlop készítése Egy ml ülepített Affi-Gel 10-et (Bio-Rad) 17 mg 144 BS monoklonális antitesthez kötünk a gyártó cég előírásai szerint: az Affi-Gel 10-et zsugorított üvegszűrőn mossuk, először hideg desztillált vízzel, majd 0,1 MNaHC03 oldattal (pH=8,0; kapcsoló-puffer). A gél 50%-os szuszpenzióját - kötő-pufferben - műanyag csőbe öntjük, azonos mennyiségű tisztított MAb-oldattal hozzuk össze és 4 órán át szobahőmérsékleten kevertjük. Kötődés után a gélt a kötő-puff érrel mossuk és a lereagálatlan helyek blokkolása érdekében 0,1 ml 1M etanolamin.HCl-dal (pH=8,0) kezeljük 1 -2 órán át szobahőmérsékleten. A gélt PBS-el mossuk 10 mM NaN3 jelenlétében és eközben 4 °C-on tartjuk. 22 22. példa Rekombináns IFNa tisztítása immunaffinitáskromatográfiával A rekombináns IFNa-t termelő feltárt E. coli sejtpéldánál E. coli HB101/pAM94 (vö. a 15. példával) - szuszpenzióját centrifugálással derítjük Sorvall 6SA rotorban, 4 °C-on, 20 percen át, 12000 ford/perc mellett. Polietüén-imint (Polymin P, Fluka, pH=8,0) adunk a felülúszóhoz 0,25% (súly/térf.) végső koncentrációig. Az oldatot 1 óra hosszat keverjük, majd centrifugáljuk Az üledéket eldobjuk és a felülúszóhoz szilárd ammónium-szulfátot adunk 65%-os telítésig. Az anyagot 1 órán át keverjük, majd centrifugáljuk. A felülúszót eldobjuk és az üledéket egytized térfogatnyi (15-20 ml) PBS-ben (pH=7,2) szuszpendáljuk Az oldatot egy éjszakán át dializáljuk 0,02% NaN3-et tartalmazó PBS-sel szemben. A dializált oldatot 1 ml 21. példa szerinti immunaffinátás géllel keverjük el. A keveréket gyengén rázzuk 1 óra hosszat, majd oszlopba töltjük és ezután egymás után mossuk 5 oszlop-térfogat PBS-sel, 5 oszlop-térfogat 0,5 M NaG és 0,2% Triton X-100 tartalmú PBS- sel, majd 5 oszlop-térfogat PBS-sel. Vagy: az immunaffinitás gélt először betol tjük az oszlopba, majd a dializált oldatot rávisszük a tetejére és ezután mossuk úgy, ahogy leírtuk A rekombináns hibrid IFNa-t (,3iD2D3D4”) 0,1 M citromsavat és 0,3 M NaG-t tartalmazó savanyú pufferrel (pH=2,5) eluáljuk Az aktív IFN-frakciókat 1M írisszel semlegesítjük, PBS- sel szemben dializáljuk, ezután ultraszűréssel kb. 0,1 mg/ml fehérje tartalomig koncentráljuk XM10 membránokon (Amicon Corp.; fiat bed membrános). A 21. példa szerinti 17 mg 144 BS MAb-t tartalmazó immunadszorbens oszlop maximális kapacitása EFNa-2 és IFNa-3 polipeptidre körülbelül 1,2 mg, IFNa- 1 típusú polipeptidre legalább 0,8 mg „B^D^” hibrid interferonra 1,15 mg, „BiD2B3B4” hibrid interferonra 1,25 mg, ,31D2D3D4" hibrid interferonra 1,25 mg, „BjB2B3D4” hibrid interferonra 0,44 mg, „BjD2B3D4” hibrid interferonra 1,15 mg, „B1D2D3II4” hibrid interferonra 1,6 mg, ,31B2D3D4” hibrid interferonra 1,15 mg és „DjD2B3B4” hibrid interferonra 1,25 mg. Az immunadszorbens gélt legalább 50 elválasztáshoz fel lehet használni kapacitásvesztés nélkül. Az ezzel a módszerrel tisztított rekombináns IFNa-2, IFNa-3 és IFNa-1 típusú polipeptidek SDS-PAGE-el homogénnek bizonyultak. 23. példa Immunodot analízis Az immunodot analízist R. Hawkes és munkatársai [Anal. Biochem., 119,142 (1982)] szerint végezzük. A természetes vagy rekombináns interferonok mintáit - különböző koncentrációkban - nitrocellulóz lapokra cseppentjük. A pontnyi cseppeket levegővel szárítjuk be és a nitrocellulóz fennmaradó kötő-kapacitását egy 10% lószérum tartalmú trisz pufferrel (0,15 M NaG, 0,01 M triszJHG; pH=7,6) blokkoljuk. A nitrocellulóz csíkokat a 144 BS MAb oldatával (23 (ig/ml) inkubáljuk, valamint összehasonlításul az azonosan készített 2K2 MAb oldattal (30 |xg/ml), negatív kontrollként normál egér immunglobulin oldattal (1:100 hígításban) vagy pozitív kontrollként anti-humán interferon-poliklonális egér szérummal (Enzo; 1:1000 hígításban). Mosás után a csíkokat peroxidázzal jelzett nyúl anti-egér immunglobulinnal (Nordic; 1:400 hígításban) kezeljük és a lekötött második antitestet a peroxidáz szubsztrátumával, 4-kloro-1 -naf tollal, hívjuk elő. A monoklonális antitest az IFNaD típusú polipeptideket (üyen az IFNa-3) egészen 0,4 ng/folt koncentrációig festi meg, az IFNaB típusú polipeptideket (üyen az IFNa-2) 10 ng/folt koncentrációig, míg a 2K2 MAb csak az IFNaD típusú polipeptideket ismeri fel (4 ng/folt). 24. példa Bead-radioimmm-tandem-assay a.) A 144 BS moniklonális antitest jelzése [25I-dal: A 144 BS MAb 0,1 mg-ját 125I-nátrium-jodiddal (1 mCi) és klóramin-T-vel jódozzuk. F. C. Greenwood és munkatársai [Biochem. J„ 89,114 (1963)] standard módszerével. A reakcióterméket ioncserélő oszlopon (Bio-Rad AG; 1 x8) tisztítjuk és aktivitását 4-105 cpm/ml-re állítjuk be PBS-sel való hígítással. A 2K2 MAb jódozását hasonló módon végezzük el. A radioizotóppal jelzett YOK és NK2 monoklonális antitestet a kereskedelemből, a Celltechtől beszerezhetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 23
