203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 2. táblázat A 150. aminosavnál cross-averes hibrid IFN-ek szerkesztéséhez felhasznált DNS-fragmentumok eredete (Zárójelben tűntetjük fel az IFN típusát és fragmentumon lévő IFN kódoló szakaszt) A keletkezett hibrid IFN-típus Összekapcsolt DNS-fragmentumok (hossza) A klón és a plazmid jele Pvuü-Pstl (~4 Kb) Pvuü-Sau3A (170 bp) Sau3A-PstI (210 bp a-2) (320 bp a-3) ,JDtD2D3B4” pJC334 Am2(a-31_92) Am2(a-393_ j 50) Am21(a-2151_166) ,J)1D2B3D4” pJC337 Am21(a-293_150) Am2(a-3i5i_i66) pJC342 Am21(a-2i_92) Am2(a-393_150) Am21(a-2151_166) ,1B[B2B3D4 pJC344 Am21(a-2j_92) Am21 (a-293_ j 30) Am22(a-3151_166) mot a 4. példában leírt lépcsős eljárással kapcsoljuk bői csak kétféle transzformált sejtet kaptunk; pAM65 össze (lásd a 3. táblázatot), ezután E. coli HB101 sejte- (, J)1B2D3D4”) és pAM90 („BjD2B3B4”). két transzformálunk, de a várt négyféle szerkezetek-3. táblázat A 61. aminosavnál cross-overes két hibrid IFN-gén szerkesztéséhez felhasznált DNS-fragmentumok eredete (Zárójelben tűntetjük fel az IFN típusát és fragmentumon lévő EFN kódoló szakaszt) A keletkezett hibrid IFN A klón és a plazmid A DNS-fragmentumok típusa (hossza) HindIÜ-Sau3A (424 bp) Sau3A-Pvuü (97 bp) Hindlü-Pvun (~4 Kb) .»D1B2D3D4” pAM65 Am2(a-3j_6i) Am21 (^“2^2-92^ Am2(a-393_166) ,3iD2B3B4” pAM90 An^lía^j^!) Am2(a-362_92) Am21 (a-293_ j 66) A másik két hibrid IFN- gént, amelyekben a 61. aminosavnál van a cross-over, úgy szerkesztjük meg, hogy úgy a pAM65, mint a pAM90 plazmidot Hindül-al és Pvuü-vel hasítjuk és a kis HindÚl-PvuII DNS-fragmentumot (521 bp) agaróz gél elektroforézis után izoláljuk. A pAM90 HindHI-íVuH kis fragmentumának és a pAM2 Hindin-PvuII nagy fragmentumának ligázzal való összekapcsolása eredményezi a pAM94-et („B,D2D3D4”) és a pAM65 Hindlíl-PvuII kis fragmentumának a pAM21 HindHI-PvuII nagy fragmentumával való összekapcsolása eredményezi a pAM76 plazmidot („DjB^B^j”). A fenti négy plazmid DNS-szerkezetét restrikciós enzim analízissel erősítettük meg. A megfelelő kiónok elnevezése a következő: E. coli HB101 pAM65, pAM90, pAM94 és pAM76. ü.rész Az a-2/a-3 hibrid interferonok szerkesztése és klónozásuk Saccharomyces cerevisiaebe Minden alább leírt hibrid interferon-proteint kódoló szekvenciát a PH05 promoterhez és a PH05 transzkripciós terminator szignálokhoz kapcsolunk, ezt beklónozzuk a pJDB 2 p. élesztő vektorba, amellyel a GRF18 S.cerevisiae törzset transzformáljuk. 6 6. példa A p31RT(L72) kifejezző plazmid szerkesztése A pJDB207/IF2(51 A72 plazmidot (100561 számú európai szabadalmi bejelentés) Hindül-mal és EcoRI-gyel emésztjük és egy 470 bp hosszú fragmentumot - ez a fragmentum tartalmazza az a-2 interferon C-terminális végét és a PH05 transzkripció terminátor 35 szignálokat - izolálunk agaróz gél eletktroforézissel és elektroelucióval [R. Yang és munkatársai, Methods Enzym., 68, 176 (1979)] Micro-Collodion zsákok használatával (Sartorius, Göttingen, NSZK). A p31R plazmidot (lásd a 100561 számú európai szabadalmi 40 bejelentést) Hindül-mal és EcoRI-el emésztjük és a 4,1 Kb vektor részt ugyanezzel a technikával izoláljuk A vektor 200 ng-ját és a DNS-inszertumot összekapcsoljuk E. coli T4 DNS-ligáz segítségével. Az E. coli HB101 sejtek transzformálása után - az ampicillin re- 45 zisztens sejtekből - izoláljuk a p31RT(A72) elnevezésű plazmidot, amely a PH05 promotert, az a-2 interferon C-terminális végét és a PH05 transzkripció terminátor szignálokat tartalmazza. A plazmid szerkezetét restrikciós analízissel igazoljuk 50 7. példa A pJDB207 PH05/IFN AM 104, AMI 14 és AM 119 plazmidok szerkesztése A p31RT(A72) PH05 expressziós plazmidot (lásd a 55 6. példát) EcoRI-gyel és Xhol-gyel emésztjük és a hiányos 3’ végeket dCTP, dGTP, dATP és dl l'P hozzáadásával, az E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragment ja segítségével betöltjük A tompa végeket ezután defoszforiláljuk bakteriális alkalikus foszfátázzál. A pJC334, 60 pAM90 és pJC337 plazmidokat (lásd a 4. és 5. példát) 17
