203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 szétválasztjuk és a frakciók radioaktivitását Cerenkovszámlálással határozzuk meg. A beépített linkerrel rendelkező radioaktív pBR322-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és a DNS-t TNE-vd és etanollal csapjuk ki. A DNS-üledéket restrikciós puff erben reszuszpendáljuk és BclI-vel emésztjük, majd a vizes fázis fenol/klorof ormos extrahálása után újre kicsapatjuk az anyagot. A lineáris DNS-t ezután 5 pg/ml koncentráció mellett, ugyanolyan körülmények közt, mint amilyeneket a linker ligáz reakciójánál leírtunk újra gyűrűbe zárjuk. A DNS-t (összekapcsolt) Hindii! és PvuII enzimmel hasítjuk a maradék intakt pBR322 eltávolítására és Pstl-el majd Hindül-Pstl nagy fragmentumot (3600 bp+linker; bp=bázis pár), amely a replikációs kezdőpontot és az ampR gént tartalmazza, szacharóz gradiensben, centrif ugálással izoláljuk. A szacharóz gradiens centrifugálissal kapott CG- pBR(AP)/LyDFN-a-2 (1160 bp) és CG- pBR(AP)/LyIFN-a-3 (1020 bp) fragmentumból szármzó Hindül-Pstl inszertumokat (76489 számú európai szabadalmi bejelentés) a fentiek szerint készített DNS-be építjük be (ligázzal), s így kapjuk a pAM4 és pAM2 plazmidot, melyek LyIFN-a-2-t, illetve LyIFN-a-3-at kódoló szakaszt tartalmaznak, ß-laktamáz promoter irányítása alatt. Ezt a DNS-t közvetlenül használjuk kompetens E. coli transzformálására a következőképpen: a DNS-ligázos keverékét (vagy ennek egy részét) 150 pl 15 mM triszüCl (pH- 7,5), 10 mM CaCl2 10 mM MgCl2, 10 mM NaG és 0:5 mM EDTA tartalmú oldatba visszük át és ehhez hozzáadjuk a kalcium-kloriddal kezelt recipiens E. coli HB101 sejtek 50 |xl-ét. A keveréket 0 °C-on tartjuk 20 percig, ezután 42 °C-on 2 percig, majd szobahőmérsékletre való hűtés után 1 ml N- táptalajt adunk hozzá. Az inkubálást 37 °C-on folytatjuk 1 órán át (rázógépben; 250 ford/perc), ezután 600 pl-ét tetraciklin tartalmú (10 pg/ml) McConkeyagarra (Difco) szélesztjük. A Petri-csészéket 37 °C-on inkubál juk 16-18 órán át, ekkor már megfigyelhetők a baktériumtelepek. A transzformált sejtekből a plazmid DNS-t a következő eljárással kapjuk meg. Egy-egy transzformált telepet oltunk 10 ml tetraciklin tartalmú (10 pg/ml N- táptalajba és a tenyészetet 37 °C-on rázzuk (rázógépben; 150-300 ford/perc) addig, míg optikai sűrűsége el nem éri a 0,9-1,1 (650 nm) értéket. A sejteket leszüreteljük és azonos térfogatú, tetraciklint (10 pg/ml) és klóramfenikolt (80 pg/ml) tartalmazó N-táptalajban reszuszpendáljuk. Az inkubálást 37 °C-on 18 órán át folytatjuk, hogy megnöveljük a plazmid sejtenkénti másolat számát. A baktériumokat szeparáljuk és az üledéket 50 mM-os triszüQ-ben (pH- 8) -10 ml/1 g nedves sejt - reszuszpendáljuk, majd annyi lizozimet (Sigma) adunk hozzá, hogy konentrációja a végén 2 mg/ml legyen. Az oldatot 10 percig 0 °C-on tartjuk és ekkor 50 mM EDTA-t adunk hozzá, majd 10 perc múlva - 0 °C-on - Triron X100-at adunk az oldathoz 0,8% végső koncentrációig. A preparátumot ekkor 0 °C-on tartjuk 1 órán át, ezután 30 percig centrifugáljuk Sorvall SS-34 rotorban, 18000 ford/perc mellett. A tiszta felülúszót először fenollal extraháljuk, ezután két kloroformos extrakció következik, majd RNáz A-t (Sigma) adunk hozzá 25 pg/ml végkoncentrációig. Az oldatot ezután 37 °C-on inkubál juk 1 órán át Az RNS eltávolítására NaQ-t (1 M végkoncentrációig) és polietüén-glikol 6000-et (7,5% végkoncentrációig) adunk az oldathoz. A preparátumot -10 °C-on tartjuk 2 órán át, ezután 10 percig centrifugáljuk Sorvall SS-34 rotorban, 10000 ford/perc mellett, 0 °C-on. Az üledéket 200 pl TNE-ben reszuszpendáljuk, újra extraháljuk fenol: kloroform (1:1) keverékével, ezután etanollal kicsapjuk: 500 pl etanolt adunk hozzá, 5 percig - 80 °C-on tartjuk, majd 10 percig Eppendorf-centrifugában centrifugáljuk. A DNS-üledéket 20-40 pl TE- ben reszuszpendáljuk. Ennek az eljárásnak a jellemző kitermelése mintegy 20 pg plazmid DNS. Az izolált plazmid DNS-eket (pAM4 és pAM2) restrikciós enzim analízisnek vetjük alá, így ellenőrizzük a pAM4 és pAM2 szerkezetét. 2. példa A 3’extracisztron PvuII hely eltávolítása a pAM4- böl A pAM2 (a-3)-tól eltérően, a pAM4 (a-2) két PvuII helyet tartalmaz (lásd a 3. ábrát). Annak érdekében, hogy megkönnyítsük az IFN-kódoló régión belül a PvuH helyen a hibrid IFN-gének szerkesztését, az extracisztron szakaszon belüli második PvuII helyet el kell távolítani. A pAM4 plazmidnak ez a módosítása lényegében az IFNa-2 cDNS 3’extracisztron szekvenciájának a ddetálását jelenti a PstI és a 3’extracisztron PvuII helye között (lásd a 3. ábrát). A pAM4-et részlegesen emésztjük Pvuü-vel [50 mM NaCl-t 6 mM MgG2,6 mM 2-merkapto-etanol és 10 mM trisz.HCl-t (pH= 7,5) tartalma - zó oldatban 5 pg pAM4-hez 1 EJ pg PvuII-t (Biolabs) adunk, 5 percig 37 °C-on emésztjük, a reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le] és hozzákötjük (ligázzal) 32PPstl linkerhez (Collaborative Research) az 1. példában leírt eljárás szerint A DNS keverékkel E. coli HB101 sejteket transzformálunk, mint fent és 16 telep plazmidnál restrikciós enzimes analízissel - PstI, PvuII és HíndlH használatával - szűrővizsgálatot végzünk pontos méretű (246 bp) deléció jelenlétére. A szűrt 16 telepből háromnál a pAM4 módosulatlan volt, egy multimernek bizonyult, ötnél nagy deléció (620 bp) keletkezett és kettő hordozta a kívánt kis deléciót (246 bp). Egy rövidített IFN-a-2 inszertummal rendelkező kiónt (Hindül-Pstl kis fragmentum, 907 bp hosszú) szelektáltunk és pAM21 -nek neveztük el. 3. példa PvuII hibridek szerkesztése cross-over hellyel a 92. aminosavnál Mind a pAM2 (a-3), mind a pAM21 (a2) plazmidot Hindül-al és Pvuü-vel hasítunk, s ennek az lesz az eredménye, hogy kihasítuk olyan 521 bp hosszú DNS- fragmentumokat, melyek ß-laktamaz promoter szekvenciákat és az IFN-gének N-terminális felét (1-92 aminosav kódoló rész) tartalmazzák. A nagy és a kis 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
