203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 A találmány tárgya új hibrid interferonok rekombináns DNS-technológiával mikrobiológiai úton való előállítása, továbbá ezen új interferonoknak az alkalmazása vírusbetegségek és neoplazmás betegségek kezelésénél. A különböző mitogének és vírusok hatásának kitett eukarióta sejtek sokasága által szekretált interferonok (INF-ek) egy polipeptid családot alkotnak. Az interferonokat kémiai és biológiai jellemzőik alapján három csoportba osztják be: IFN-a, IFN-ß és IFN-y. Az IFN a és IFN-ß gének főként olyan sejtekben fejeződnek ki, amelyeket vírusokkal, vírus alkotórészekkel és kettősszálú RNS-sel kezelnek. Ezzel szemben az IFN-7 mitogénekre adott válaszként szintetizálódik. A humán EFN-a-t egy legalább 15 nem allél-típusú génből álló géncsalád kódolja. Az IFN-ß-t és IFN-y-t egyedüli gének kódolják. Az IFN-a elsődleges transzlációs terméke 189 aminosavból áll (kivéve az IFN-a2-t, amely 188 aminosavat tartalmaz), amelyből a 23 aminosavból álló szignál peptidet a transzlációt követő módosítással távolitják el. A 187, illetve 186 aminosavból álló EFN-ß-bol, illetve EFN-y-ból a 21, illetve 20 aminosavat magába foglaló szignál peptidet kell eltávolítani. Az IFN-a szubtípusok aminosav szekvenciájának homológiája 80-85%-os, míg az IFN-ß és IFN-a közti homológia körülbelül 30-40%-os Az IFN-y csak egyes aminosavaknál mutat az IFN-a-val homológiát, amely azt jelenti, hogy körülbelül 12%-ban varrnak azonos csoportjaik. Az EFN-ek vírusellenes, immun-moduláns, valamint citotoxikus hatást fejtenek ki. Kimutatták, hogy az IFN-a szubtípusoknak (például EFN-a2, IFN-a j) különbözik a célsejt specificitásuk. Az IFN-a2 és IFN- al antivirális aktivitása közel azonos marhasejtek esetében (MDBK), de az IFN-a2 kétszer hatásosabb az IFN-a [-nél humán sejtek esetében (WISH) és harmincszor kisebb a protektiv hatása, mint az IFN-ap nek egérsejtek esetében (L-929), [M. Streuli és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78,2848 (1981)]. Azt a tényt, hogy a sokgénes IFN-a családtagok vírusellenes aktivitásának mértéke és specificitása különböző, bizonyos IFN-a „hibridek”-kel kapott eredmények erősítették meg (32134 számú európai szabadalmi bejelentés; 4414150 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ezeket a „hibrid”-eket úgy szerkesztették meg, hogy két interferon-a szubtípust kódoló gént hasítottak PvuII restrikciós enzimmel (vagy két esetben Bglü-vel) és a keletkező fragmentumokat úgy kapcsolták össze ligázzal, hogy az egyik IFN gén amino-terminálisát kódoló DNS-szekvencia a másik IFN gén karboxi-terminálisát kódoló DNS-szekvenciával fuzionált. Bár ezek a hibridek interferonok célsejt specificitásukban - összehasonlítva őket a szülői interferonokkal - változást mutatnak, azonban nem volt kimutatható, hogy gyengült vagy csökkent volna a háromfajta interferonaktivitás bármelyike is. Bizonyos csökkenés vagy korlátozás azonban kívánatos lehet, például klinikai alkalmazás esetén, amikor egyetlen problémára, például vírusfertőzésre volna szükséges összpontosítani az interferonterápiát, mégpedig úgy, hogy ne keletkezhessenek komplikációs faktorok az alkalmazott interferon más irányú hatásai következtében. Ennélfogva a jelen találmány egyik tárgyát olyan új hibrid interferonok képezik, amelyek sokkal specifikusabb biológiai aktivitást fejtenek ki egyetlen - interferon által indukált - biokémiai folyamat szelektív és uralkodó aktiválódása következtében és/vagy azáltal, hogy a természetes interferonok bizonyos nemkívánatos olyan mellékhatásai, amelyek használatukat korlátozzák, üyenek az influenzaszerű tünetek (például láz, fejfájás és fáradtság), a gyomor-, bélzavarok, vérnyomásesés, hajhullás, eltűnnek vagy csökkennek. A találmány szerint előállított hibrid interferonok humán limfoblasztoid interferonokból származnak: a LyIFN-a-2-ből, melynek szekvenciája a következő: CYS ASP LEU PRO GLN IHR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU. valamint a LyIFN-a-3-ból, amelynek szekvenciája az alábbi: CYS ASP LEU PRO LU THR HIS SER LEU ASP ASN ARG ARG THR LEU MET LEU LEU ALA GLN MET SER ARG ILE SER PRO SER SER CYS LEU MET ASP ARG HIS ASP PHE GLY PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP GLY ASN GLN PHE GLN LYS ALA PRO ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU LEU ELE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU. Ezeket az interferonokat és előállításuk módszereit a 76489 számú európai szabadalmi bejelentés tartalmazza. A LyIFN-a-2 rokonságban van (de nem azonos vele) a humán leukocita LeIF-aB interferonnal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
