203198. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immungátló, monokin-, különösen interleukin-1-gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 198 B 2 1.1 .b Emberből származó monocita-monokin gátlása Egészséges önkéntes egyénekből vett vérből egymagvű sejteket nyertünk centrifugálással, és e sejteket szövettenyésztő edényekben a vizsgálandó vegyület különböző koncentrációinak jelenlétében tenyésztettük [J. Immunoi. 138, 496 (1987)]. A nem tapadó limfocitákat 4 óra múlva többszörös mosással eltávolítottuk. Ezután friss közeget, vizsgálandó vegyületet és stimulánsként lipopoliszaccharidot (a következőkben: LPS) adtunk hozzá, és a monocitákat 19 órán át inkubáltuk. Az összegyűjtött tenyésztőközeget 1:10 térfogatarányban friss közeggel hígítottuk, és összeolvadó nyúl-porcsejtekhez adtuk. További 2 nap elmúltával meghatároztuk a porcsejttenyészet közegében az MP- aktivitást. E vizsgálat során a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 és KI jelű vegyületek - a monokin felszabadulását körülbelül 30-100 |xM koncentráció-tartományban gátolták. Meghatároztuk a lényegében tiszta (Z)-izomer alakban lévő D2 és KI jelű vegyületek ED50-értékét 3 vagy 7 külön kísérletben (minden egyes kísérletet összesen három párhuzamosban végeztünk), és azt 60-100 pM nagyságrendűnek találtuk. 1.2. LAF-vizsgálaii módszer (timocita-burjánzás vizsgálata) A monokin aktivitásának standard vizsgálati módszere a limfociták burjánzásának vizsgálatán alapul. Ez a módszer igen érzékeny, azonban viszonylag kevéssé specifikus, mivel az EL-2, a forbol-mirisztát-acetát, kon kan a valin A, prosztaglandin-E és az indometacin zavarják. Emberi monocitákból tenyésztőközeget állítottunk elő a fenti 1.1.b. szerint, ezt 1:10, 1:20 és 1:40 térfogat arányban hígítottuk, és milliliterenként 1,5 x 10-6 timocitát (ezeket C3H/HeJ törzsű egerekből nyertük) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-közeghez adtuk, amely ezen kívül 20 mM (hidroxi-etil)-piperazin-etánszulfonsavat, 12 mM nátrium-hidrogén-karbonátot, 2 mM glutamint, 2% borjúmagzatszérumot, 10 pM 2-merkapto-etanolt, 0,1 pM indometacint és antibiotikumokat tartalmazott. A sejteket 2 napig 96-üreges tenyésztőlemezen inkubáltuk, és a burjánzás mértékét az utolsó 6 órában alkalmazott 3H-timidin (üregenként lp.C) bevitelével határoztuk meg. A beépült radioaktív komponenst tartalmazó terméket szűrőpapírra gyűjtöttük, és meghatároztuk a radioaktivitását. E vizsgálat során a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek a monokin termelődését körülbelül 30-100 pM koncentráció-tartományban gátolták. Meghatároztuk a lényegében tiszta (Z)-izomer alakban lévő D2 és Hl jelű vegyületek ED50-értékét 2 különálló kísérletben (mindkét kísérletet három ismétlésben végeztük), és azt 30 pM nagyságrendűnek találtuk. Abból a célból, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületeknek a fenti LAF-módszerben alkalmazott egér-timocitákra kifejtett anlagonista, illetve közvetlen befolyását kizárjuk, meghatároztuk a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek hatását a 3H-timidin beépülésére a timociták rekombináns emberi DL-1-vel vagy U-2-vel végzett stimulálása után. E vizsgálat során a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 és H1 jelű vegyületek - a 10 ng/ml rekombináns emberi IL-2 koncentrációval vagy 75 ng/ml rekombináns humán EL-1 koncentrációval indukált burjánzást nem befolyásolták lényegesen, és koncentrációfüggés sem volt megfigyelhető. A továbbiakban meghatároztuk az MP-nek IL-1 által kiváltott elválasztására gyakorolt befolyását porcsejtek - mint az IL-1 célsejtjei - alkalmazásával. Az EL-l-et (beszerezhető: a Genzyme Corporation cégtől, USA) a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyülettel vagy anélkül, vagy dexametazonnal (mint kontrollal) porcsejtekhez adtuk, és 2-napos inkubálás után a felülúszó közegben meghatároztuk a fém-proteináz aktivitását. E vizsgálat során a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 és Hl jelű vegyületek - az MP-nek IL-1-okozta elválasztását nem befolyásolták. 1.3. Radioimmm-mérés: az IL-1 kvantitatív meghatározása Az 1.1.b szerinti eljárást követtük, és a kapott, nem hígított tenyésztőközegben az IL-1 koncentrációit CISTRON IL-1 radioimmun-mérő készlettel (beszerezhető a Cistron cégtől, 10, Bloomfield Avenue, P.O-Box 2004, Pine Brook, NJ 07 058 USA) meghatá-roztuk. Ez a mérőmódszer az EL-lß-ra specifikus, és mind a sejten kívüli, mind a sejten belüli anyag érzékelésére alkalmas. E vizsgálat során beigazolódott, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - különösen a D2 és K1 jelű vegyületek - a sejten kívüli (extracelluláris) IL-1 koncentrációját csökkentik. Ezzel szemben a sejten belüli (intracelluláris) IL-1 koncentrációja lényegében változatlan maradt. Meghatároztuk a lényegében Z-izomer alakban lévő D2 és Hl jelű vegyületek Ed50 értékét az extracelluláris IL-1 koncentráció csökkentésében 2-8 kísérletben (minden egyes kísérletet összesen három párhuzamosban végeztünk), és azokat 40-25 vM nagyságrendűnek találtuk. Minden egyes meghatározásunk azt mutatta, hogy az extracelluláris IL-1 tartalom jelentős mértékben csökkent. 1.4. A felszabadulás, illetve a szintézis gátlásának vizsgálata 1,4a Homogenizátumok és lizátumok előállítása Hevítéssel inaktivált 1% emberi AB-szérumot tartalmazó, 0,3 ml foszfáttal puff erőit fiziológiás konyhasóoldatot adtunk kimosott, összetapadó emberi monocitákhoz, és utána a sejteket leválasztottuk. A sejteket tartalmazó oldatot azonos csoporthoz tartozó két másik üvegbe vittük át, és ezt az eljárást háromszor ismételtük. Az így kapott 0,9 ml térfogatú szusjg>enziót Dounce homogenizáló berendezéssel (gyártója a KontesCo, Vineland, NJ) homogenizáltuk úgyjhogy a B-zúzót ötször alkalmaztuk hét ütéssel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
