203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 természetes zsírsav-acil-koenzim A- származékok képzésének hiánya a szokásos táptalajokon letális mutációt eredményezhetne, ha a membrán épsége a nevezett származékoktól függ; vagy, ha a 2-oxosavak felhalmozódása az előbbi mutánsban citotoxikus hatású. Továbbá, egyik mutánstól sem lenne elvárható, hogy az L-izoleucin vagy az L-valin lebontásának eredményeként acetil-CoA-t és propionil-CoA-t legyen képes előállítani, mivel ez a mutánsokban hiányzó enzimaktivitást kívánná meg. Mivel ezek az acil-CoA-származékok, amint azt fentebb már jeleztük, szükségesek az avermektin bioszintéziséhez, feltételezhető, hogy a mutánsok nem-természetes avermektin termelése súlyosan sérült. Meglepetésre, nem ez a helyzet. Az itt leírt mutánsokban az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- aktivitás hiánya megakadályozza az elágazó láncú zsírsav-acil-CoA szintézisét az L-izoleucin, az L-leucin és az L-valin lebontási termékeiből, így meggátolja a természetes avermektinek szintézisét. Hasonló módon, az elágazó láncú aminosav- transzamináz-negatív S. avermitilis mutánsokban is hiányzik az elágazó láncú zsírsav-acil-CoA szintézis, és így a természetes avermektinek szintézisére is képtelenek. A zsírsav-acil-CoA hiánya két okra vezethető vissza. Először: az ilyen, transzamináz-negatív mutánsok nem tudnak elágazó láncú 2- oxosavakat szintetizálni a táptalajból származó izoleucinból, leucinból és valinból a szokásos transzaminációs reakcióval. Másodszor: ezekben a transzamináz-mutánsokban az elágazó láncú 2-oxosavaknak a sejt elágazó láncú aminosav-bioszintézis útján való keletkezését meggátolja az, hogy a fermentációs táptalaj ezeket az aminosavakat szükségszerűen tartalmazza. A fenti aminosavak, mint az anyagcsere-út végtermékei, a jól ismert enzim-represszió, és feed-back gátlás útján megakadályozzák ezen bioszintetikus út működését (és a 2-oxosav köztestermékek termelését). Az aktív, elágazó láncú 2-oxosavak hiánya hathatósan gátolja az elágazó láncú zsírsav-acil-CoA zsírsav-acil-CoA szintézist. A jelen találmány tárgya tehát eljárás a fenti 2-oxosav- dehidrogenáz-negatív, illetve transzamináz-negatív mutánsok, valamint az elágazó láncú tmaszamináznegatív és 2-oxosav-dehidrogenáz-negatív mutációkat együttesen hordozó mutánsok felhasználására. Az „avermektin” vagy „avermektinek” megnevezés a továbbiakban az (I) általános képlet szerinti vegyületekre vonatkozik, ahol a 25-ös helyzetben található szubsztituens (R) az álábbiakban ismertetésre kerülő csoportok valamelyike lehet. Az itt leírt mutánsok különösen értékesek a nemtermészetes avermektinek termelése szempontjából, az alábbiakban részletezett, és példákkal szemléltetett eljárásokban. Különösen alkalmasak bizonyos preferált avermektinek, így olyan vegyületek előállítására, ahol a C-25 szubsztituense 4-6 szénatomos cikloalkil- vagy cikloakenilcsoport, esetleg egy vagy két 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituálva; l-(metil-tio)-etilcsoport, vagy egy 5- vagy 6-tagú, egy oxigén- vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos csoport, így 3-tienil- vagy 3-furil-csoport. A Streptomyces avermitilis faj avermektin-teimelő törzseinek mutagén kezelését az ismert eljárásokat követve, bármely mutagén ágenst felhasználhatva végezhetjük, illetve az ultraibolya- és röntgen-besugárzást alkalmazhatunk a mutagén ágensek közül az N-metil- N’-nitro-N-nitrozóguanidinnal, az etil-metán-szulfonáttal, salétromossavval és a nitrogénmustárokkal, például az N-metil-bisz(2-klór-etil)aminnal vagy más, hasonló anyagokkal végezhetünk kezeléseket. A mutagén kezelést a természetes avermektinek termelésére képes S. avermitilis törzsek, például a S. avermitilis ATCXC 31272 spóráin, vagy vegetatív tenyészetein végezhetjük el. A követekző eljárások jól ismertek a szakemberek előtt. A mutagenizált telepek közül olyan biokémiai vizsgálati módszer alapján választjuk ki az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- hiányos mutánsokat, amely nagyszámú, random módon mutagenizált baktériumtelep [I4C-l]-2-oxosavakból történő 14C02-fejlesztésének vizsgálatát teszi lehetővé [Tabor és munkatársai, J. Bact., 128, 485-486. (1976)]. A módszer szerint a mutáns telepeket mikroliter lemezek lyukaiban, megfelelő táptalajban, növesztjük, permeábilissá tesszük a sejteket toluollal, és [,4C-1]-2-oxosavat [például 2-oxo-izokapronsavat] adunk minden lyukba, majd a tenyészet feletti levegőrétegben vizsgáljuk a l4C02 jelenlétét. A [14C-l]-2-oxo-izokapronsav helyett [14C-l]-2-oxo-3-metil-valeriánsavat vagy [14C-l]-2- oxo-3-metil-butirilsavat is használhatunk. A l4C02 termelését kényelmesen ellenőrizhetjük a felszabaduló 14C02 elnyelését szolgáló, bárium-hidroxiddal telített, nedves szűrőpapírt helyezve az egyes lyukak fölé: az esetleg keletkezett, jelzett bárium-karbonát autoradiográfiával kimutatható. Az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitással nem rendelkező mutánsok autoradiogramja közelítőleg megegyezik a vak kontroliéval, azaz a mutánsokból nem kapunk jelzett bárium- karbonátot. Az így nyert mutánsokat újabb mutagén kezelésnek vetjük alá, bármely fent említett mutagén ágens felhasználásával. Az elágazó láncú aminosav-transzferázaktivitással nem rendelkező mutánsokat a mutagenizált telepek közül úgy választjuk ki, hogy ezek a mutánsok nem képesek M9/glükóz jelű minimál táptalajon növekedni, hacsak a táptalaj nem tartalmaz L-izoleucint, L-leucint és L-valint (ILV). Mindhárom aminosavra szükség van ahhoz, hogy a növekedés meginduljon. Kimutatható továbbá, hogy az említett transzamináz-negatív mutánsok nem növekednek a transzamináz-reakciók szubsztrátjaként szolgáló, mindhárom ketosavval kiegészített táptalajon. Mindhárom ketosav (2-oxo-3-metil-valeriánsav, 2-oxo-izokapronsav, 2-oxo-izovaleriánsav) transzaminációját, tehát egyetlen transzamináz enzim katalizálja. Különösen érdekesek a kétszeresen blokkolt, sem az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz, sem az elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsok, hiszen természetes avermektineket termelő tenyészetekké való visszaalakulásuk valószínűsége igen kicsi. Az egyszeresen blokkolt mutánsok bizo5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
