203130. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok előállítására
1 HU 203 130 B 2 képlettel jellemezhető savakká átalakítható vegyületektől mentes táptalajban tenyésztjük. Az oligomicin-A retenciós ideje jellemzően 12,5-14 perc. A retenciós idők (RT) hányadosa az avermektin-termékek azonosságára, illetve hozamának összehasonlításához biztosabb alapot kínál. Az avermektin-termékek általában B2, A2, B1 és A1 sorrendben jelennek meg a nagynyomású folyadék-kromatogramokon. Természetes avermektin RT/RT (oligomicin-A) B2b 0,70 B2a 0,84 A2b 0,90 A2a 1,09 Blb 1,40 Bla 1,83 Alb 1,83 Alá 2,42. Nem természetes RT/RT (oligomicin-A) avermektin (R: ciklopentil-csoport) ciklopentil-B2 0,94 ciklopentil-A2 1,23 ciklopentil-Bl 1,99 ciklopentil-A1 2,62. A következő példákban az avermektineket a fentebb leírt nyagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárások alapján határozzuk meg. A vegyületek elnevezése az alábbi: „A”-sorozat: R2 3 * *-metilcsoport, „B”-sorozat: R3-hidrogénatom, „l”-jel: 22,23-kettőskötés, R‘-H, „2”-jel: nincs 22,23-kettőskötés, R‘-OH. 1. példa A ciklopentil-avermektin-A2 előállítása A S. avermitilis 1-3 (TCC 53567) törzs sejtjeit 28- 30 °C hőmérsékleten, AS-7 táptalajban 24 órán át rázógépen tenyésztjük. A tenyészet 5 ml-ével 100 ml, 500 ml térfogatú lombikban levő AS-7 táptalajt oltunk, és változatlan körülmények között 24 órán át inkubáljuk a tenyészetet. Az így nyert tenyészet 1 ml-ével oltjuk az AP-5 táptalajt (40 ml táptalajt 300 ml térfogatú lombikban), melyhez 24 órával később 0,4 g/1 ciklopentán-karbonsavat adunk (nátrium-só alakjában). A termelő lombiktenyészeteket 28-30 'C hőmérsékleten rázatjuk. A 240. óráig 35 mg/1 ciklopentil-avermektin-A2 termelődik, míg a megfelelő természetes A2a titere 0. Más ciklopentil-avermektinek is képződnek. 2. példa A áklopentil-avermektin-A2 előállítása Fagyasztott S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) tenyészettel oltunk 100 ml, 500 ml térfogatú lombikban levő AS-7 táptalajt. A sejteket 28-30 °C hőmérsékleten, 24 órán át rázógépen tenyésztjük. A tenyészet 1 ml-es alikvotjaival oltunk két további, 100 ml AS-7 táptalajt tartalmazó, 500 ml térfogatú lombikot, és 18 órás inkubáció után ez utóbbi tenyészetekkel oltunk 10 1 AP-5 (csökkentett nátrium-klorid koncentrációjú) táptalajt. 24 órás, 28 °C hőmérsékleten végzett tenyésztés után 0,4 g/1 ciklopentán-karbonsavat adunk a táptalajhoz. A keverést úgy végezzük, hogy az oldott oxigén koncentrációját a telítési érték 20%-a felett tartsuk. A ciklopentil-A2 titere a 120., 168., 216., 264. és a 312. órában 16, 40, 65, 88és 110 mgA. Ezzel ellentétben, a megfelelő, természetes avermektin- A2a titere a fenti mitákban 0 (azaz nem észlelhető). 3. példa A ciklopentil-avermektin-A2 előállítása Ezen eljárás szerint a termelő táptalajt dúsítjuk, és a ciklopentán-karbonsavat több részletben adagoljuk a ciklopentil- avermektin titer növelése érdekében. Az oltóanyag előállítását, valamint a fermentációt ugyanazon körülmények között végezzük, mint a 2. példában leírt eljárásban, a következők kivételével: további 5 g/1 (összesen tehát 10 g/1), Ardamine pH-t használunk az AP-5 táptalaj előállításához, és 0,4,0,2, illetve 0,2 g/1 ciklopentán-karbonsavat adagolunk a fermentléhez 30, 172 és 220 órával a fermentáció kezdete után. A ciklopentil-avermektin-A2 titere 1, 2, 11, 78, 137, illetve 214 mgA 120, 168, 216, 264, illetve 312 órás fermentáció után. 4. példa Ciklopentil-avermektinek előállítása A S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) törzs egy fagyasztott tenyészetével oltunk 500 ml térfogatú, dugóval lezárt lombikban levő 100 ml AS-7 táptalajt, majd a tenyészetet 24-28 órán át, 28-30 "C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a fenti tenyészet 1 miével oltunk 40 ml, 300 ml térfogatú lombikban levő AP-5 táptalajt (amely kevesebb nátrium-kloridot, viszont 0,6 g/l-rel több glutaminsavat tartalmaz). 96 órán át, 28-30 °C hőmérsékleten rázógépen inkubáljuk a tenyészetet, majd 0,4 g/1 ciklopentán- karbonsavat (nátrium-só formájában) adunk hozzá. A 216 órás minta nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálata B2, A2, Bl, illetve A1 ciklopentilavermektinek jelenlétét mutatja 12,32, 15,86, 25,28, illetve 32,% perces retenciós idővel. 5. példa Ciklopentil-avermektin-A2 előállítása Ezen eljárás szerint az S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) és az S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) törzsek sejtjeit azonos körülmények között tenyésztjük. Három táptalajt (AP-5, WPM Syn A 40:40 és WPM Syn B 40:40) használunk. A két mikroorganizmus fagyasztott tenyészeteivel beoltunk 500-500 ml térfogatú, dugóval lezárt lombikokban levő 100-100 ml AS-7 táptalajt, majd a tenyészeteket 24-26 órán át, 28-30 “C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a két te5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
