203112. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BU-3608 antibiotikumok N-alkil-származékainak és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 KU 203 112 B 4 I. táblázat In vitro gombaellenes hatás Vegyület MIC ((Xg/ml) (előállítási példa száma) C. albicans C. neofonnans A. fumigatus T. menta graph tes 3. 3,1 1,6 100 100 5. 6,3 1,6 6,3 6,3 6. 3,1 1,6 12,5 25 7. 6,3 1,6 12,5 25 8. 3,1 0,8 6,3 6,3 9. 6,3 1,6 25 12,5 10. 12,5 12,5 100 50 A jelen találmány szerinti vegyületek in vivo hatását egérben, A9540 számú Candida albicans törzzsel okozott fertőzéssel szemben vizsgáltuk. A vizsgálandó organizmusokat 18 órán át 28 ‘C-on YGP (élesztő extraktum glükóz, pepton, dikálium-hidrogén-foszfát, magnézium-szulfát) táptalajon tenyésztettük, majd sóoldatban szuszpendáltuk. 20-24 g-os hím ICR egereket a vizsgálandó gomba átlagos letális dózisának kb. tízszeresével intravénásán fertőztünk. Az antibiotikum különböző mennyiségeit közvetlenül a gombás fertőzés után intravénásán adtuk be az 5 egérből álló csoportoknak. Azt a dózist, amely az állatok 50%-át megvédi a fertőzéstől (PO», mg/kg) a fertőzés utáni 20. napon észlelt túlélési arányból számítottuk. A kontroll állatok mindegyike elhullt a fetőzést követő 7-15. napon. Az 5., 7. és 8. példa szerinti vegyületek PD» értéke 14 mg/kg (toxikus), 11 mg/kg és 3,5 mg/kg. A találmány a fentiekkel összefüggésben kiterjed gombás fertőzések kezelési eljárására is, amely szerint egy érzékeny gombával fertőzött egyednek a jelen találmány szerinti vegyület antifungális szempontból hatásos mennyiségét adjuk be. Emberek és állatok kezelésére a jelen találmány szerinti antibiotikumok antifungálisan hatásos mennyiségét bármely szokásos módon, így például intravénásán, intramuszkulárisan, orálisan, intranazálisan és felületi fertőzések esetében topikálisan adagolhatjuk. A parenterális beadásra alkalmas készítmények között a steril vizes vagy nemvizes oldatokat, szuszpenziókat vagy emulziókat említhetjük. Ezek steril szilárd készítmény formájában is elkészíthetők, amelyek közvetlenül a felhasználás előtt steril vízben, fiziológiás sóoldatban vagy más steril injektálható közegben oldhatók. Az orális készítmények lehetnek tabletták, zselatin kapszulák, porok, pasztillák, sziruprác és hasonlók. Topikális alkalmazásra a vegyületet tejekbe, kenőcsökbe, gélekbe, krémekbe, tinktúrákba és hasonlókba foglalhatjuk. Az egységdózis formákat a gyógyászati készítmények területén jártas szakemberek által általánosan ismert módszerek alkalmazásával állíthatjuk elő. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti antibiotikumokra érzékeny gombával fertőzött egyed kezelésekor az előnyös adagolási módot és dózist a gombás vagy vírusos fertőzések kezelésében jártas klinikai szakember állapítja meg, és ezek a fertőzést okozó organizmustól, annak az antibiotikummal szembeni érzékenységétől, a fertőzés súlyosságától és helyétől, valamint a beteg jellemzőitől, így korától, testtömegétől, a kiválasztás sebességétől, az egyidejűleg alkalmazott más gyógyszerrel való kezelésétől és az általános fizikai állapotától függően változnak. A következő példák a korlátozás szándéka nélkül mutatják be a találmányt. 1. példa A P157-2 Actinomadura hibisca törzs fermentációja (a) Ferde agar tenyészet A Pl 57-2 Actinomadura hibisca törzset ferde agaron tenyésztjük, amely 0,5% oldható keményítőt (Nichiden Kagaku Co.), 0,5% glükózt, 0,1% halhús extraktumot (mikuni Kagaku), 0,1 % élesztőkivonatot (Oriental Yeast Co.), 0,2% NZ kazeint (Sheffield); 0,1% kalcium-karbonátot, 02 nátrium-kloridot és 1,6% agart tartalmaz. A tenyészetet 28 'C-on 7 napon át inkubáljuk. (b) Oltótenyészet A ferdeagar tenyészet egy részletét 500 ml-es Erlenmeyer lombikba visszük, amelyben 100 ml következő összetételű vegetatív táptalaj van: 1,0% glükóz, 2,0% oldható keményítő (Nichiden Kagaku Co.), 0,5% NZ amine A (Sheffield); 0,5% élesztőkivonat (Oriental Yest Co.) és 0,1% kalcium-karbonát. A közeg pH-ját sterilezés előtt 7/2-re állítjuk. Az oltótenyészetet 28 'C-on, percenként 200 fordulattal rázatjuk 4 napon át. (c) Lombikfermentáció Az oltótenyészetből 5 ml-es részletet 500 ml-es, 100 ml steril előállítási táptalajt tartalmazó Erlenmeyert lombikba viszünk. A táptalaj összetétele a következő: 3,5% glükóz, 3,0% szójaliszt (Nikko Seiyu Co.), 0,5% Pharmamedia (Traders Protein), 0,1% élesztőkivonat (Oriental Yeast Co.) és 0,3% kalcium-karbonát. A fermentálást 5-6 napig 28 'C-on, rázatás közben végezzük. A fermentáció alatt az an tibiotok um - termelést hígításos módszerrel, Candida albicans A9540 indikátor organizmus felhasználásával Sabouraud dextróz tenyészetben követjük nyomon; 0,01 n nátrium-hidroxid és metanol 1:1 térfogatarányú elegyében készült oldatban 500 nmen UV meghatározást is végzünk. Az antibiotikum termelése a 650 pg/ml maximumot az 5. napon éri el. (d) Fermentáció tankban 3 liter oltótenyészettel egy 200 literes tankfermentor ban levő 120 liter steril előállítási táptalajt oltunk be. Az előállítási táptalaj összetétele megegyezik a lombikfermentációhoz használtéval. A tank tartalmát 28 'C-on 250-es percenkénti fordulattal kevertetjük, és percenként 120 liter levegőt buborékoltatunk át rajta. 96 órás fermentálás után 500 pg/ml antibiotikum koncentrációt kapunk, a tenyészet pH-ja 7,9. 2. példa Az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása A BU-3608, BU-3608 B és BU-3608 C antibiotiku mok elkülönítési és tisztítási eljárásának részletes leírását a 4.870.165 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás adja meg. A D és E komponensek elkülönítését és tiszítását a 345.735 sz. európai szabadalmi leírás írja le. Az antibiotikum komplex különböző komponenseinek elkülönítési és tisztítási módját a következőkben ismertetjük. A 7,8 pH-jú tenyészetet centrifugáljuk, és a felülúszót 6 n sósavval pH 2,0-ig savanyítjuk a bioinaktív szilárd anyag kicsapására. A csapadék eltávolítása után a szűrlet pH-ját 6 n nátrium-hidroxiddal 5,0-re állítjuk, és az oldatot 30 pe-cig óvatosan, szobahőmérsékleten kever5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
