203045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászatilag hatásos proteinek stabilizálására hidrogélekben
HU 203045B állítjuk és az emulziót rövid ideig ülepedni hagyjuk. Ezután az emulziót újra keverjük és körülbelül 50% vízmennyiség eléréséig vizet adunk hozzá, ekkor az emulzió finom olaj/víz emulzióba vált át. A második eljárási művelet során az így kapott előemulziót a pufferoldatba bekeverjük és diszpergáljuk, majd hozzáadjuk a hidrogélképzőt és duzzadni hagyjuk. A protein-oldat hozzáadásának időpontja nem kritikus, ezt előnyösen utolsó műveletként végezzük. A találmány szerinti előnyös eljárással igen stabü emulziókat kapunk, amelyek szobahőmérsékleten fél évig tárolva sem hajlamosak a krémesedésre. Kisebb tételeknél, valamint ha műszakilag jobb homogenizátorok, így porlasztó-homogenizá torok állnak rendelkezésre, akkor egy olaj/víz emulzió előállítását előemulzió készítése nélkül, egyetlen műveletben is elvégezhetjük, a találmány szerinti előnyös eljárás az emulzió stabilitása mellett egyszerű, csekély energetikai és műszaki ráfordítást igénylő és egyidejűleg kíméletes előállítást tesz lehetővé. Az alábbi példák a találmányt gyógyászatiig hatásos proteinekként IFN-alfa, IFN-gamma és TNF- alfa proteinekkel készített hidrogél-készítmények alapján szemléltetik. 5 1. példa Gél előállítása 100 g gél tartalmaz: IFN-gamma 0,1 g metil-paraben 0,2 g nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrát 0,05 g dikálium-hidrogén-foszfát-trihidrát 0,04 g Natrosol 250 HX (hidroxil-etil-cellulóz) 1,75 g Polisorbat20 0,1 g paraffinolaj, hígan folyó 1,0 g víz, ionmentesített 100 g-ra 96,76 g A hidrogén előállítását az előnyös, kétműveletes eljárással végezzük a következőképpen: a) Az előemulzió előállítása 80 °C hőmérsékletű vízben (az összmennyiség kb. 90%-a) keverés közben feloldjuk a foszfátokat és a metil-paraben konzerválószert, és ezután az oldatot szobahőmérsékletre lehűtjük. A polisorbat 20 emulgeátort a paraffinolajban gyorsforgású homogenizátorral eloszlatjuk, és lassan, keverés közben annyi vizet adunk hozzá, amíg körülbelül 30%-os durva víz/olaj emulziót kapunk. Ezt az emulziót rövid ideig állni hagyjuk, ekkor szétválik. Ekkor a keverőt újra bekapcsolva az emulziónál fázisváltást idézünk elő, s így igen finom eloszlású olaj/víz emulziót kapunk. b) a hidrogél előállítása A sterilen szűrt pufferoldatba bekeverjük a paraffinolaj-emulziót és abban finoman eloszlatjuk. Ezután az emulzióba míkrobiológiailag tiszta hidroxi-etil-cellulózt szórunk és keveréssel eloszlatjuk. Abból a célból, hogy tökéletes duzzadást érjünk el, a gélt 10-15 órán át lamináris áramlással duzzadni hagyjuk. Végül lassan bekeverjük a 4 mg/ml-re beállított IFN-gamma-oldatot. A keveréket laminárislevegő-áramlási körülmények között steril tubusokba töltjük. A tárolási kísérletek lefolyását az 1. ábra szemlélteti. Amint az a diagrammból látható, a paraffinolaj hozzáadása biztosítja az IFN-gamma aktivitásának megmaradását, amit az ELISA-teszttel mértünk (az ELISA-tesztben használt antitestek megkötik azokat a biológiailag aktív proteineket, amelyekre specifikusak); a diagrammban látható csekély csökkenés a teszt szórását tekintve nem szignifikáns. A 2. ábra ábra 0,5% zselatinnal, mint egy hidrogél-készítmény komponensével végzett összehasonlító kísérletet szemléltet, az 1. példa szerinti összetételben, de stabilizátor külön hozzáadása nélkül, amiből a zselatinnak az IFN-gammára kifejtett jelentős destabilizáló hatása kitűnik. Ha a zselatint hidrogélképzőként használjuk, akkor ezek szerint feltétlenül szükséges hatásos stabilizátort hozzáadni. A 3. ábra a stabilitás alakulását szemlélteti 15 hónap időtartamon át (ezen az ábrán, valamint a 4„ 5. és 6. ábrákon is, az ordinátára a gyógyászatiig hatásos protein koncentrációjának természetes logaritmusát vittük fel). 6 2. példa Gél előállítása 100 g gél tartalmaz: IFN-gamma 0,1 g metilparaben 0,2 g nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrát 0,05 g dikálium-hidrogén-foszfát-trihidrát 0,04 g Natrosol 250HX (hidroxi-etü-cellulóz) 1,75 g PluronicF68 0,1 g paraffinolaj, hígan folyó 1,0 g víz, ionmentesített 100 g-ra 96,76 g A foszfátokat, a metilparaben konzerválószert és a PluronicF68 emulgeátort 80 °C hőmérsékletű vízben feloldjuk, majd az oldatot szobahőmérsékletre lehűtjük és sterüen szűrjük. Ezután a keverékhez adjuk a paraffinolajat és homogenizátorral eloszlatjuk, majd vákuumban, keverés közben hozzáadjuk a hidroxi-etil-cellulózt és végül a 4 mg/ml-re beállított IFN-gamma-oldatot. A gél letöltését az 1. példa szerint végezzük. 3. példa Gél előállítása 100 g gél tartalmaz: TNF-alfa 0,1 g metilparaben 0,213 g nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrát 0,053 g dikálium-hidrogén-foszfát-trihidrát 0,0427 g Natrosol 250HX (hidroxi-etü-cellulóz) 1,87 g Polysorbat 20 0,107 g paraffinolaj, hígan folyó 1,07 g víz, ionmentesített 100 g-ra 96,5443 g A hidrogél előállítását az 1. példában megadott 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
