202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 számlálásával mértük, amely kontroll csövet éppen úgy alávetettük a fenti eljárásnak azzal a kivétellel, hogy a monoklonális antitesthez hővel inaktivált (56°C, 30 perc) normál nyúlszérumot adtunk, és nem végeztünk mosást a be nem fogott baktériumok eltávolítására. Amint a 2. táblázatból látható, csak a Fisher-féle 2. immun-típusú baktériumok fagocitózisa ment végbe 6F11 monoklonális antitest és egy komplement aktív forrása jelenlétében. Mikor ezt a kísérletet megismételtük Fisher-féle 1. immun-típusú baktériumokat alkalmazva Fisher-féle 2. immun-típusú baktériumok helyett, baktérium-felvétel nem volt megfigyelhető, ez így demonstrálta a 6F11 antitest baktériumokat opszonizáló és fagocitózist elősegítő képességének fajlagosságát. Mivel az opszoninok (fajlagos antitestek) és polimorf-magvú leukociták (neutrofil sejtek) kombinált tevékenysége tűnik a P. aeruginosára való immunitás elsődleges mechanizmusának (Pollack, fentebb idézett munka), ezek az adatok azt sugalják, hogy a 6F11 antitestek, megfelelő beadási körülmények között, védelmet nyújtanak a Fisher-féle 2. immun- típusú baktériumok ellen. 2. táblázat 6F11 Antitest8 Komplement15 A bevitt ^-Fisher-féle 2. immun-típusú baktérium százalékos felhasználása — — 3,8 +-6,6-+ 2,4 + + 61,7 a(-)-tenyésztő tápközeg b(-)«hővel inaktivált komplement G. In vivo aktivitás Hogy a fenti hipotézist megvizsgáljuk, állatok védelmével foglalkozó tanulmányokat hajtottunk végre a 6F11 antitestekkel és többféle Fisher-immun-típusú P. aeruginosával. A 6F11 antitestet először használt tenyészet felülúszóból koncentráltuk telített ammóniumszulfáttal végzett kicsapással (50% végső koncentráció) (Good, A.H. és munkatársai: Purification of Immunoglobulins and Their Fragments/ Immunoglobulinok és fragmenseik tisztítása), Selected Methods in Cellular Immunology, szerkesztők: Mishell, B.B. és Shiigi, S.M., kiadó: W.H. Freeman and Co., San Francisco, Kalifornia, 279-286 (1980). A kicsapott anyagot steril vízben újra helyreállítottuk, erőteljesen dializáltuk PBS-sel szemben és sterilre szűrtük. Negatív kontrollként az azonos folyamatnak alávetett friss tenyésztő tápközeg szolgált. Nőstény BALB/c egereket 20 és 22 g testsúly között két csoportra osztottuk, minden csoport 10 egeret tartalmazott. Egy csoportot intraperitoneálisan (i.p.) inokuláltunk koncentrált 6F11 antitest 0,5 ml-ével (amely kb. 50 |ig antitestet tartalmazott radioimmunassay-val meghatá- rozva), míg a másik csoport i.p. 0,5 ml koncentrált tenyészet-tápközeget kapott. Hat órával később az összes állatot i.p. 0,3 ml élő baktérium szuszpenzió hatásának tettünk ki, amely Fisher-féle 2. immun-típusú P. aeruginosa baktériumokat tartalmazott. A baktérium-szuszpenziót már korábban elkészítettük olyan módon, hogy logaritmikus fázisú növekedésben levő tápközeg- tenyészetből a bektériumokat centrifugáltuk, kétszer mostuk PBS- ben és újra felszuszpendáltuk a megfelelő sűrűségig PBS-ben. A baktériumos fertőzés 1,2*108 élő organizmust képviselt. Az állatokat 5 napos perióduson át figyeltük. 18 órával a baktériumok bejuttatása után az összes állat, amely koncentrált tenyészettápközeget kapott, elpusztult. Ezzel ellentétben azok az állatok, amelyek 6F11 monoklonális antitestet kaptak, mind éltek, Az utóbbi csoport egészen egészségesnek látszott ebben az időpontban, a baktériumos fertőzésnek csak apróbb tüneteivel (pl. a bunda enyhe felborzolódása). Ezek a tünetek is eltűntek 48 órával a beadagolás után, és a baktériumos betegségnek semmiféle bizonyítéka nem maradt a megfigyelési periódus további részében. Hasonló kísérleteket hajtottunk végre más Fisher-féle immun- típusú P. aeruginosa fertőzéssel 5LD50 mennyiségben, ez nem eredményezett védelmet 6F11 antitestekkel. Ezek az adagok világosan demonstrálják, hogy a passzívan átvitt 6F11 antitest teljes és fajlagos védelmet nyújt P. aeruginosa halálos fertőzést jelentő adagja ellen. II. példa AII. példa módszert mutat be Fisher-féle 4. immuntípusú P. aeruginosa elleni humán monoklonális antitest előállítására. Perifériás vér limfocitákat (PBL) alkalmaztunk, amelyeket előzőleg P. aeruginosa-val fertőzött emberből nyertünk. Tíz lemezt oltottunk be 2000 E' PBL/üreg-gel plusz 40 000 1A2 sejt/üreg-gel Iscoveféle módosított Dulbecco tápközegben, amely ki volt egészítve 15% (térf./térf.) FCS-sel, 2 mmól/1 L- glutaminnal, 1000 nemzetközi egység penicillinnel, 100 pj/ml sztreptomicinnel és HAT-tal, ahogyan ezt az I. példában leírtuk. Ezt a tápközeg összeállítást ezután itt Iscove- féle tápközegnek fogjuk nevezni. Az I. példában leírt meghatározási eljárást alkalmaztuk, kivéve, hogy az E. coli és K. pneumoniae lemezeket nem alkalmaztunk. Az üregek egyikének, amelyet 9D10-nek neveztünk, felülúszója csak a Fisher-féle 4-7. immun-típust tartalmazó lemezen volt pozitív, és ezt követően ezt Fisher-féle 4. immun-típusra fajlagosnak határoztuk meg, amikor az egyedi immun-típusú antigén-lemezeken mértük. A sejtek klónozását a 9D10 üregből besugárzott humán PBL-t (2,5»105/üreg) alkalmazva tápláló sejtekként 0,5 területű 96 üreges laposfenekű lemezeken, és Iscove-féle tápközeget alkalmazva HAT kiegészítés nélkül végeztük, de az eljárás egyébként ugyanaz volt, amelyet korábban leírtunk. A jelen szabadalmi bejelentés benyújtása előtt az itt leírt 9D10 sejtvonalat elhelyeztük az Amerikai Fajta-tenyészet Gyűjteményben (ATCC), ahol a CRL 8752 jelzést kapta. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
