202925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 6/23 konszenzus promotert tartalmazó expressziós vektor előállítására
1 HU 202 925 B 2 don végeztük. A poliakrüamid gélelektroforézis - 4 és 8%-os, 1 mm vastag, vertikális géleket alkalmazva - a Maniatis, T., Jeffrey, A. and van de Sande, H. (1975) [Chain length determination of small double and single-stranded DNS molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry 14, 3787-3794] által közölt recept szerint történt. DNS fragmentumok izolálására agaróz és poliakrilamid gélekből Winberg G„ Hammarskjöld, M. (1980) [Isolation of DNA from agarose gels using DEAE-paper. Application to restriction site mapping of adenovirus type 16 DNA. NAR, 8, 253] DEAE papírt alkalmazó módszerét használtuk. Kompetens sejteket a HB101, C600 IM101 és ED8800 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] CaCl2-os eljárással készítettünk. DNS fragmentumok 5’ végeinek defoszforilása, végjelölése polinukleotid kinázzal és -32 ATP-vel és a nukleotid szekvencia meghatározása a Maxam, A. and Gilbert, W. (1980) [Sequencing end-labeled DNA with basespecific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65 499-560] által leírt protokol szerint történik. Az oligonukleotid vezérelte mutagenezist Zoller módszere alapján végeztük (Zoller et. al.: Oligonucleotid-directed mutogenezis using Ml3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA, NAR 10:6487). Az expressziós vektorok előállításához használt egyéb módszerek és eljárások alkalmazásakor a Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] által leírt útmutatásokat követtük. Ábramagyarázat 1. ábra Az ábra a pERVI/23, pERVI/23(-Nsi) valamint pERVI/23 p2 konszenzus plazmidok promoter régiójának szekvenciáját ábrázolja. A konzervatív boxokat (-35-ös és -lc-es régió) szaggatott vonallal húzott téglalap keretezi be. A nukleotid helyettesítéseket (tranziciókat) a 6/23 p2 konszenzus promoter szekvenciában vastag betű jelzi. A transzkripciós iniciáció helyét X jelöli. 2. ábra Az ábra a pERVI/23, valamint a pERVI/23 p2 cons plazmid a-peptid expressziójának a mértékét mutatja- éjszakán át növesztett kultúrából történő beoltás után- az idő függvényében. abszcissza: az idő órákban mérve ordináta: az a-peptid expresszióval arányos ß-galaktozidäz komplementációs enzimaktivitás OD egységekben kifejezett értéke. 5 10 15 20 25 Deponálási adatok: Plazmidot tartalmazó törzs jele Deponálási szám Deponálás dátuma JM 107/pER-VI/23 Pip2 conc 001063 1988. júl. 13. 8 ó 50 perc JM 107/pER-VI/23 p2 conc 001062 1988. júl. 13. 8ó 50 perc SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 6/23 konszenzus promotert tartalmazó, 40 expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy rmB p2promotert tartalmazó E. coli plazmid ezen promoterét Ml3 fágba klónozzuk, az átvitt promoter -35 régióját TTGACA szekvenciává, a -10 régióját TATAAT szekvenciává alakítjuk át irányított mutagenezissel, 45 majd az átalakított promotert pERVI/23 plazmidba vagy valamelyik származékába klónozzuk végül, kívánt esetben eltávolítjuk a -10 régió végéről induló TGCA szakaszt. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási plazmidként a p204229-10 vagy p20429-13 plazmidot használjuk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az irányított mutagenezist az alábbi szekvenciájú oligonukleotiddal vezéreljük: TTGACACTGTAGCGGGAAGGCGTATAATGCATCAC CCCG 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakított promotert a pERV1723, a pERVI/23 pLH4, pERVI/23 pLH5, a p med/23, a pL alfa Int/23, a pERVI/23[- ATG], vagy a pERVL'23 [+ATG] plazmidba klónozzuk. 5
