202925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 6/23 konszenzus promotert tartalmazó expressziós vektor előállítására
1 HU 202 925 B 2 A találmány szerinti eljárás során a 6/23 konszenzus promotereket célszerűen oligonukleotid vezérelte mutagenezissel alakítjuk ki, majd a plazmidba való klónozást követően, kívánt esetben a 6/23 konszenzus promotert a TGCA szekvencia kihasításával 6/23 [-Nsi] promoterré alakítjuk. A találmány értelmében az átalakított promotert a pERVI/23 plazmidba vagy valamely származékába klónozzuk. A klónozáshoz előnyösen az alábbi plazmidokat használhatjuk: pERVI/23, pERVI/23 pLH4, pERVI/23 pLH5, p med/23, pERVI/23[-ATG] vagy pERVI/23[+ATG] expressziós vektorokat. Találmányunk részleteit a következő példákkal szemléltetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákban ismertetettekre korlátoznánk. 1. példa A pER-VI/23 p2 és a pER-VI/23 pip2 konszenzus kiónok kialakítása A. rmB p2 és rmB promoterek elkülönítése Az átalakítást párhuzamosan két plazmiddal végeztük el. A Boros I. által leírt p20429-10 és p20429-13 jelű plazmidból (Boros I.: Kandidátusi értekezés 1984. MTA Budapest) Pst I és Bell restrikciós enzimekkel kivágtunk két-két DNS fragmentumot. Az egyik fragmentum a ß-laktamäz génben lévő egyedi Pst I restrikciós hely, és a 16 S rRNS gén kódoló régiójának elején lévő Bel I restrikciós hely közötti DNS szakaszt tartalmazta, amelyen megtalálható az intakt rmB p2 promoter (a p20429-10 plazmidnál), valamint az írnB pi és p2 promoterek (a p20429-10 plazmid esetében). A másik fragmentum mindkét plazmid esetében azonos volt, és az előbb említett Bel I hely, valamint az rmB terminátoroktól downstream lévő másik Bel I hely közötti DNS régiót tartalmazta. (Ti, T2 term.) B. rmB p2 és rmB p2pi promoterek klónozása M13 fágba Az azonos plazmidból kapott fragmentumokat - T4 DNS ligázzal - B am Hl és Pst I restrikciós enzimekkel emésztett M13 Mpl8 bakteriofág DNS-hez kapcsoltuk. Minthogy a Bam Hl és Bel I ragadós végek egymással összeligálhatók mindkét esetben - elvben - háromféle különböző fágot kaphatunk:- A Pst I végek összekapcsolódása után a fragment DNS Bel I vége és a fág DNS Bam Hl vége közvetlenül összekapcsolódhat, (ezáltal a fág cirkularizálódik)- Az előbb említett Bel I, Bam Hl szabad végek közé az rmB tenninátorokat tartalmazó Bel I-Bcl I végű fragment inszertálódhat, az eredeti plazmidhoz képest megegyező, vagy ellentétes orientációban. A valóságban csak a két utóbbi konstrukciót sierült megkapni. Ez nem meglepő, mert közismert tény, hogy erős promoterek igen nehezen klónozhatók a terminátoraik nélkül. A két létező konstrukció egyaránt alkalmas a mutagenezis targetjeként, a Ti T2 rmB terminátok mindkét orientációban funkcióképesek. C. konszenzus szekvenciák kialakítása mutagenezissel a promoterek -35 és -10 régióikban Mindkét plazmid származékai közül kiválasztottunk egy-egy rekonbináns fágot és ismert módon (Maniatis, T„ Fritsch, E.F., Sambrook. J. (1982): Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York) elvégeztük rajta az oligonukleotid vezérelte mutagenezist. A mutagenezis során használt oligonukleotid a következő volt: TTGACACTGTAGCGGGAAGGCGTATAATGCATCACCCCG A fenti oligonukleotid képes a rekombináns fágok+szálához hibridizálódni, s három nukleotid kivételével a klónozott p2 promoterrel komplementer. A három eltérést bekarikázás jelzi. Az első kettő egy-egy T-A tranzíció (helyettesítés), amely a két konszenzus boxot alakítja ki, a harmadik egy T inzerció, amelynek következtében egy egyedi Nsi I restrikciós hely alakul ki a mutáns fágban. Ez rendkívüli mértékben megkönnyíti egyrészt a mutánsok kiválasztását, másrészt a konszenzussá alakított promoter visszaklónozását az expressziós vektor plazmidba. A mutáns promoter abban is külünbözik az eredetitől, hogy a -35 régiót érintő változás - a konszenzussá alakulás mellett - egyben egy Hinf I hasítóhely megszűntét eredményezi. Ez szintén felhasználható a szelekció során (1. ábra). Mindkét csoportba tartozó fágok közül kerestünk olyanokat, amelyek emészthetők Nsi I-gyel. A fágok úgynevezett replikatív formája lényegileg plazmidoknak tekinthető, a sejtből bármelyik standard plazmi tisztítási eljárással preparálható. Példaként említjük a Maniatis és munkatársai (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York, Laboratóriumi kézikönyv vagy Bimbóim és munkatársai (1979) Nucl. Acid Res. (7) 1513-1523 irodalmi helyeket. A megadott módszer szerinti mutagenizálás hatásfoka olyan nagy, hogy aránylag kisszámú (esetünkben 24 db) független klónból a fentiek szerint fágot (fág DNS-et) preparálva és megemésztve őket Nsi I enzimmel, több olyat is találtunk, amely a kívánt mutációt hordozta. D. az átalakított promoterek klónozása pERVI/23 plazmidba Egy-egy ilyen fágot emésztettünk Pst I, Nsi I-gyel és a kapott fragmentumot ligáltuk a Pst I, Nsi I-gyel emésztett pER-VI/23 plazmid nagyobbik fragmentjéhez, majd transzformáltunk E. coli K12 JM 107-törzsbe. A nagyobbik fragment izolálását a Dretzen és munkatársai (1981) Anal. Biochem. (112) 295-298 irodalmi helyen ismertetett módon végeztünk. Az eredményül kapott plazmidokat restrikciós enzimekkel térképeztük. A plazmidok túlnyomó része a várt képet adta. (Nem tartalmazták a -35-ös régióval átfedő Hind I helyet) E. a kapott pERVI/23 p2 és pERVI/23 ptp2 konszenzus klónok fehérje expressziójának vizsgálata A pERVI/23 p2 konszenzus kiónok esetében (a p204229-10 plazmid származékai) az in vitro komle-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
