202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 percre 1 mól/1 trisz-HCl-lel (pH-8) telített szűrőpapírra helyezzük. A szűrőket ismét szárazra itatjuk, majd 5 percre 1,5 mól/1 trisz-HCl-lel (pH-8) és 3,0 mól/1 NaCl-lel telített itatóspapíiTa helyezzük. A szűrőket levegőn szárítjuk, majd sütjük 80 'C hőmérsékleten két órán át vákuumban. A fenti folyamat lizálja a sejteket és denaturálja a DNS-t, amely ekkor a sejtekben van, és irreverzibilisen hozzáköti az egyszálú DNS-t a nitrocellulóz szűrőhöz. A fentebb leírt folyamat készíti fel a szűrőket a hibridizáláshoz. 4. példa A pKC407 plazmid megalkotása A pKC407 és pKC408 plazmidokat megalkotjuk, hogy rendelkezzünk olyan vektorokkal, amelyeknek a következő jellemvonásai vannak: (1) Streptomyces erythreus eritromicin rezisztencia gén jelenléte; (2) olyan S. erythreus DNS jelenléte, amely eltér attól a DNS-től, amely az eritromicin rezisztencia átadásához szükséges a minimumon tartva; és (3) csupán jól jellemzett DNS jelenléte a plazmádon. A pD43 plazmád nem felel meg a fenti követelményeknek, következésképpen a pKC407 és pKC408 plazmidokat alkotjuk meg. A. E. coli K 12 803/pIJ43 tenyésztése és a pIJ43 plazmid izolálása E. coli K 12 803/pIJ43 (ATCC 39156) 5 ml-es tenyészetét növesztjük TY tápközegen (1% tripton, 0,5% élesztőkivonat és 0,5% nátrium-klorid, pH-7,5), amely 100 pg/ml ampicillint is tartalmaz, hagyományos mikrobiológiai eljárásokat alkalmazva. A sejteket egy asztali centrifugában összegyűjtjük, és a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 1 ml oldatban (I- oldat), amely 0,3 mól/1 szacharózt, 25 mmól/liter EDTA-t (etilén-diamin- tetraecetsav) és 25 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 8,0) tartalmaz. A sejteket ezután átvisszük egy Eppendorf csőbe és centrifugáljuk mintegy 1 percig, és az üledéket újra szuszpendáljuk 0,5 ml I. oldatban. Mintegy 50 jrl frissen készített lizozimot adunk (20 mg/ml vízben) az újra szuszpendált sejtekhez, és az oldatot 37 °C hőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk. 250 pl frissen készített lizáló keverék (2% nátriumdodecil-szulfát és 0,3 n NaOH) hozzáadása után a lizált sejteket azonnal és tökéletesen vortexeljük. A sejteket ezután 10 percig inkubáljuk 50 °C hőmérsékleten, lehűtjük, és 100 pl fenol-SEVAG keveréket (fenol-kloroform-izoamilalkohol 25:24:1) adunk hozzá. Miután az extrakciós keveréket két percig centrifugáltuk Eppendorf centrifugában, a felülúszót dekantáljuk és átvisszük egy másik csőbe 70 pl nem pufferolt 3 mól/l-es nátrium-acetát oldattal és 0,7 ml izopropanollal együtt, hogy kicsapjuk a DNS-t. Ezt az oldatot 5 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd két percen át centrifugáljuk. A felülúszót gyengéden és teljesen dekantáljuk. A DNS csapadékot 500 pl TE pufferban feloldjuk (10 mmól/1 trisz-HCl, pH-8,0, és 1 mmól/1 EDTA), és 25 pl 100 mmól/l-es spermin-HCl-t adunk hozzá. A keveréket Vortex készüléken kezeljük, 5 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd 5 percig centrifugáljuk Eppendorf centrifugában. A felülúszót ismét teljesen dekantáljuk és eldobjuk, és eldobjuk, és a kicsapott DNS-t Vortex-készüléken kezeljük 1 ml olyan oldattal, amely 75% etanolt, 0,3 mól/1 nátrium-acetátot, és 10 mmól/1 magnézium-acetátot tartalmaz. Ezt az oldatot azután 5 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, és a DNS-t a fentiek szerint összegyűjtjük. Az így létrejött DNS üledéket feloldjuk 10 pl TE pufferban. B. A pIJ43 plazmid ~1,8 kb-s BamHI-PstI restrikciós fragmensének izolálása Mintegy 5 pg 4 A. példa szerint előállított pIJ43 plazmidot emésztünk l»BawHI pufferban (150 mmól/1 NaCl; 6 mmól/1 trisz-HCl, pH-7,9; 6 mmól/1 MgCl2; és 1 mmól/1 ditiotreitol) 50 pl teljes térfogatban 10 egység BamUl és Pstl restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs). A reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk mintegy 2 órán át. A reakciót fenollal, majd SEVAG-gal végzett extrahálással fejezzük be. A BamHI-vel és Pstl-vel emésztett pIJ43 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, megszárítjuk, majd feloldjuk 5 pl TE pufferban. A DNS-t 0,5 % agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá, amíg a kívánt ~1,8 kb-s BamHI-PstI restrikciós fragmens elkülönül a többi emésztési fragmenstől. Whatman DEAE cellulóz papírt helyezünk egy hasítékba a kívánt DNS csík előtt elhelyezve, és a kívánt DNS fragmenst elektroforézissel átvisszük a DEAE papírra. A DEAE papírt 1 ml TE pufferral mossuk, és a DNS-t eluáljuk a DEAE papírról 400 pl TE pufferral, amely NaCl-re 1 mól/literessé van beállítva. Az eluált DNS-t etanollal kicsapjuk, és a nyert tisztított fragmenst feloldjuk 5 pl TE pufferban. Mintegy 2 pg pIJ43 plazmid eredetű ~1,8 kb-s BamHl - Pstl restrikciós fragmenst nyerünk ezzel az eljárással. Ez a ~ 1,8 kb-s fragmens tartalmazza az eritromicin rezisztencia átadó gént. C. A BamHI-vel és Pstl-vel emésztett pEMBL9+ plazmid izolálása A pEMBL9+ plazmid olyan plazmid, amelyet Dente és munkatársai ismertettek [Nucleic Acids Research 11, 1645 (1983)]. A plazmid tartalmazza a pBR322 eredetű ß-laktamäz gént és egy többszörös klónozó helyet; a plazmid mérete mintegy 4 kb. Bár a jelen találmány szerinti konkrét példákban a pEMBL9+ plazmidot alkalmazzuk, plazmidok széles választéka létezik, amelyek ugyanúgy alkalmasak lennének a jelen találmány céljaira. Lényegében a jelen módszerhez az szükséges, hogy ha a teljes plazmid, amelyik tartalmazza az antibiotikum rezisztencia átadó gént, jelezve van és fel van használva a hibridizálási reakcióban, az összes, az antibiotikum rezisztencia átadó géntől eltérő szekvencia nem szabad, hogy homológ legyen az antibiotikum bioszintetizáló gén jelenlétéhez vizsgált DNS-hez. Ezért a pEMBL9+ plazmidot választottuk ki többszörös klónozó helye és E. coli plazmid-eredetű szekvenciái miatt. Számos más plazmid is van, amely ugyanúgy alkalmas lehet a jelen találmány céljaira, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
