202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 Az alábbi táblázatban a lizozim kifejeződés eredményeit mutatjuk be. Transzformált sajt Törzs Lizozim mg/ml tenyészet 1/29 WS21-5 0,4 1/34 WS21-5 0,31 2/30 WS21-3 0,89 2/31 WS21-3 0,42 6/30 WS21-1 1,0 6/31 WS21-1 1,2 WS21-1 - aleu2 his3 trpl pep4 WS21-3 - aleu2 his3 ura3 pep4 WS21-5 - aleu2 his3 trpl argl pep4 9. példa a-faktor promoter által szabályozott expressziás kazetta szerkesztése Különböző közlemények [G.A. Bitter és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 5330-5334 (1984); A.J. Brake és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 4642-4646 (1984)] írják le, hogyan lehet beépíteni heterológ géneket az a-faktor gén Hindin és Sáli helye közé. Itt az EcoRI és a Hindül hely közötti szekvencia mint promoter és a Sáli és EcoRI közötti szekvencia mint transzkripciós terminátor működik. a) Az a-faktomak egy megfelelő vektorba való klónozása Az a-faktor gént a pUC 13-ból származó paF-ból (5 ng), mint EcoRI-fragmentumot izoláljuk [100 mM trisz.HCl (pH-7,5), 5 mM MgCh, 50 mM NaCl, 1 mM DTT; 36 °C] és a V2 vektorba klónozzuk be. A V2 vektort a következőképen szerkesztjük meg: a pUC18-at (Pharmacia cég) Smal- gyei és HindlII-mal hasítjuk, és végeket a már leírt módon Klenow- polimerázzal kitöltjük és a pUC18 megmaradt részét összekapcsoljuk ligáz segítségével úgy, hogy a keletkező V2 vektorban az eredetileg tíz klónozó helyből már csak három (EcoRI, SstI, KpnI) maradjon. így a keletkezett V2 vektor többé már nem tartalmaz Hindül és Sáli helyeket, tehát e két enzim számára már csak az a-faktor génben vannak hasítási helyek. A V2 vektort (1 pg) EcoRI-gyel emésztjük, majd az EcoRI-gyel emésztett paF 500 ng-ját az EcoRI- gyei emésztett V2 50 ng-jával kapcsoljuk össze (a ligáz reakciót úgy végezzük, amint azt a 7. példában leírtuk). A keletkezett és E.coli HB101 sejtbe transzformált pWS203D plazmidot a további szerkesztéseknél használjuk fel (9.b és c példa). A pWS230D plazmid Pstl/BglII fragmentuma (14.a ábra) tartalmazza körülbelül 900 bp hosszú promotert. A mellette lévő PstI hely mintegy 25 bpal a transzlatált területen belül fekszik. A négy HindlII hely szomszédságában lévő PstI hely előtt 25 bp-al és tovább felfelé találhatók az a-faktor gén transzkripciójához szükséges DNS szakaszok. Az a-faktor vezérszekvenciája e második PstI helytől (ATG) körülbelül 25 bp- al balra kezdődik és meglehetősen pontosan a négy Hindül hely közül az elsőnél fejeződik be. Hoszszúsága körülbelül 280 bp-t tesz ki. A terminátor a Sáli és EcoRI hely között van. b) A HLZ gén és az a-faktor gén összekapcsolása Hogy a HLZ gént a megfelelő irányítottsággal építhessük be az a-faktor-promoterhez, illetve -terminátorhoz, a pHL14-23-at határoló Hindül és Sáli restrikciós hasítási helyeket ki kell cserélni. Ezért körülbelül 5 pg pHLK14-23-at Sall-gyel [6 mM trisz.HCl (pH=8,0), 6 mM MgCl2,150 mM NaCl; 36 °C], illen e Hindül-mal [50 mM trisz-HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 °C] hasítunk, a túllógó részeket egyenként kitöltjük Klenow-polimeráz segítségével (0,5 pg hasított DNS 25 pl reakciótérfogatban, mint a 8.b példában), majd a reakcióelegyet 1%-os agaróz gélben tisztítjuk. Egy HindlII-linkert (New England Biolabs) kötünk be a Sáli helyre (pWS207D) és egy Sall-linkert (New England Biolabs) kötünk be a HindlII-helyre (pWS206D) ligáz segítségével (a DNS fragmentumokból körülbelül 0,5 pg/pl-t veszünk) úgy, ahogy a 8.b példában leírtuk, majd ezen új plazmidokkal E.coli HB101 sejteket transzformálunk. A kapott pWS206D és pWS207D plazmidot (egyenként körülbelül 0,5 pg) EcoRI-gyel és Pstl-gvel hasítjuk [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 °C] és a fent leírt ligáz reakció feltételei mellett (7. példa) összekapcsoljuk, miáltal a pWS208D plazmidhoz jutunk. A HLZ gén 3’ végével itt is, mint ahogy a 8.d példában leírtuk, az a probléma, hogy a stop kodon után további nukleotidok vannak jelen. Emiatt a HLZ gén 3’ végét a stop kodonig megrövidítjük a következőképpen: a pWS257D plazmid (a 8.d példában leírt szerkezet) tartalmazza a HLZ gén 3’ végét a stop kodonig, ezt követően egy Saü helyet és az ADHD terminátort, aminek egyébként ebben a szerkezetben nincs jelentősége. A pWSW208D és a pWS257D plazmidot Sall-gyel és Pstl-gyel teljesen megemésztjük [PstI- gyei 1 óra hosszat emésztünk 36 °C-on, 50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl tartalmú oldatban, majd a NaCl koncentrációt 150 mM-ra növeljük és SaU-gyel emésztünk tovább], majd 1%-os agarózban tisztítjuk és izoláljuk (Dretzen és munkatársai; lásd fentebb). A pWS257D-ből származó Sa- 11/PstI fragmentum, amely tartalmazza a HLZ gén 3’ végét, pótolja a pWS208D Sall/PstI fragmentumát, amikor a pWS257D (körülbelül 500 ng) fragmentumát beépítjük a pWS208D (körülbelül 50 ng) Sall/PstI helyére ligáz segítségével úgy, mint fent. A keletkezett pWS212D elnevezésű plazmid (13. ábra) most már a teljes HLZ gént HindlII/SalI fragmentumként tartalmazza, melyben a HLZ gén 3’ vége a stop kodonnal végződik. A pWS212D és a pWS230D (9.a példa) plazmidot Hindül-mal és SaU-gyel teljesen megemésztjük [HindlII- mal 1 óra hosszat emésztünk 36°C-on 50 mmól trisz.HCl (pH-8,0), 10 mmól 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
