202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 b) Az a-faktor vezérszekvencia és a HLZ gén összekapcsolása (7. ábra) Minthogy a pWS209D-ben lévő a-faktor vezérszekvencia egy HindlII hellyel végződik és a pHL14-23- ban lévő HLZ gént 3’ végén egy HindlII és 5’ végén egy Sáli hely határolja, a pHL14- 23-mat 6 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 6 mM mgCh-t és 150 mM NaCl-t tartalmazó oldatban Sall-gyel 36 °C-on teljesen megemésztjük és a túllógó végeket Klenow-polimerázzal (25 pl összmennyiségű ligáz pufferben - lásd a 7. példában - 0,5 |ig hasított DNS, 100-100 pmól dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 1 egység Klenow- polimeráz; 30 perc; szobahőmérséklet) betöltjük. A Sall-gyel emésztett tompa végő termék tisztítását ezután 1% agaróz gélben végezzük el. Ezután következik a linker beépítése, mely egy szintetikus HindlII linker (New England Biolabs; T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 316. oldal, 1982); A linkért 1 pg/ml koncentrációban, vízben vesszük fel. A HindlII-linker kinázzal való kezelését 1 órán át 37 'C- on a következő reakcióelegyben végezzük: 1 pl 10» linker-kináz-puffer [0,66 M trisz.HCl (pH-7,9), 10 mM ATP, 10 mM Spermidin, 0,1 M MgCte, 150 mM DTT, 2 mg/ml BSA], 1 pl linker, 6 pl víz és 2 egység T4 DNS kináz. A kinázzal kezelet HindlII-linker ligáz reakciója 14 'C-on egy éjszakán át a következő elegyben megy végbe: 10 pl bt linker-kináz-pufferben 0,5 pg/ml Sallgyel és Klenow-polimerázzal kezelt pHL14- 23-mat 10 egység T4 DNS ligázzal hozunk össze. A kapott pWS207D plazmiddal, amelyben a HLZ gént most már két HindlII hely határolja, E. coli HB101 sejteket transzformálunk. Ezután a pWS207D-t Hindlü-mal megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCte, 50 mM NaCl; 36 °C] és most már a HLZ gént, mint HindlII fragmentumot, be tudjuk építeni (ligáz segítségével) a HindlII-mal hasított pWS209D-be (5 pg) az a-faktor verérszekvencia mögé. A ligáz reakcióhoz a HindlII fragmentumokat 1%-os agaróz gélben különítjük el, majd izoláljuk (Dretzen és munkatársai szerint, lásd fent). A pWS207D-ből mintegy 50 ng-ot és a pWS209D-ből mintegy 500 ng-ot használunk fel, a reakcióelegy 20 pl, mely ligáz puffert [66 mM trisz.HCI (pH-7,6), 6,6 mM MgCb, 10 mM DTT, 1 mM rATP] és 1 egység T4 DNS ligázt tartalmaz. A reakció 14 °C-on megy végbe, egy éjszakán át. A keletkezett plazmidot pWS215D-nek neveztük el, s ez a HLZ gént az a-faktor vezérszekvenciához, illetve az ADHI promoterhez képest a megfelelő irányítottsággal tartalmazza. c) Egzakt átmenet az a-faktor vezérszekvencia és a HLZ gén között A HLZ génnél egzakt N-terminális vég létrehozása azért szükséges, hogy az a proteáz hasítási hely, amely az a-faktor éréséért felelős, pontosan az érett HLZ első aminosavát meghatározó szekvencia előtt helyezkedjék el. Ezért azokat a felesleges nukleotidokat (körülbelül 20 dG-dC pár), amelyek a cDNS szerkesztéséből származtak, valamint a nukleotidoknak azon részét, amely az autentikus HLZ vezérszekvenciát kódolja, el kell távolítani. A pWS215D plazmidot Pstl-gyel teljesen megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl; 36 *C], majd egy 500 bp hosszú fragmentumot, mely az a-faktor vezérszekvencia nagy részét, valamint a HLZ gén 5* végét tartalmazza, 1%-os agaróz gélből izoláljuk (Dretzen és munkatársai, lásd fent). A fragmentumot M13 (ampl8-am4) vektorba kiónozzuk P. Carter és munkatársai szerint [P. Carter, H. Bedoulle, G. Winter, Nucleic Acids Res., 13, 4431-4443 (1985)], s ezzel E. coli TGI törzset (Amersham cég) transzformálunk. Az A2 rekombináns fágot, amely a megfelelő orientációt mutatta, használjuk kiindulási anyagként az in vitro mutagenezishez. A DNS templátot úgy készítettük, mint a didezoxiszekvenáláshoz készített tempótokat (M13 cloning and sequencing; kézikönyv; Amersham International, Egyesült Királyság). Foszfotriészter módszerrel [V.A. Efimov és munkatársai, Nucleic Acids Res., 10, 6675-6694 (1982)] szintetizáljuk az EBI124 20mer oligonukleotidot, amely az a-faktor vezérszekvencia és a HLZ gén közötti kívánt átmenetet tartalmazza és az EBI234 17mer oligonukleotidot, amely az M13 vektorban lévő ambermutációt korrigálja. Az oligonukleotidokat preparatív poliakrilamidgél elektroforézissel tisztítjuk és printerként használjuk a második szál szintetizálásához. Az oligonukleotidmutagenezist lényegében Zoller és Smith módszerével [M.J. Zoller és M. Smith, DNA, 3, 479-488 (1984)] végezzük: 150 pmól EBI234 szelekciós oligonukleotidot, amelynek szekvenciája 5’ AAGAGTCTGTCCATCAA 3’ és 150 pmól EBI124 mutagén primert, amelynek szekvenciája 5’ GGATAAAAGAAAGGTCTTTG 3’ foszforilálunk 4 egység T4 polinukleotid kinázzal (New England Biolabs) 20 pl oldatban - az oldat 50 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCl2-t, 1 mM rATP-t és 5 mM DTT-t tartalmaz - 37 °C-on 45 percig, majd 10 percig 70 °C-on hevítjük. A kinázzal kezelt primer minden 7,5 pmólját 70 'C-on hevítjük. A kinázzal kezelt primer minden 7,5 pmólját 0,5 pmól DNS-templáttal hibridizáljuk 10 pl 10 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh és 50 mM NaCl tartalmú oldatban, amelyet 3 percig 100 'C-on hevítünk, majd ezután 1 órán keresztül szobahőmérsékletre hőtjük. A denaturált keveréket jégen lehűtjük, s a térfogátát 20 pl-re állítjuk be. Az oldat 10 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCl2-t, 25 mM NaCl-t, 0,25-0,25 mM-t a dNTP-kből (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) és 0,25 mM rATP-t tartalmaz. A primert a DNS polimeráz I nagy fragmentuma (Biolabs; 1 egység) segítségével 10 egység T4 DNS ligáz (Biolabs) jelenlétében meghosszabítjuk. A reakciót 16 órán át 14 *C-on folytatjuk le. A keverékből 0,1, 1,5 és 10 pl-es kis alikvot mennyiségekkel kompetens E. coli HB2154 (szuppresszor nélkül) sejteket transzficiálunk, míg a sejtpázsitot HB2155 sejtekkel állítjuk elő [P. Carter és munkatársai, Nucleic Acids Res., 13, 4431-4443 (1985)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
