202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 TNF mRNS-t tartalmazó mRNS-frakciót hozzáadjuk a szúrón lévó DNS-hez, hibridizálás céljából. Ezután a hibridizált mRNS-t eluáljuk és visszanyerjük. A visszanyert mRNS-t Xenopus laevis oocitáiba injektálva megállapítjuk, hogy a visszanyert mRNS valóban humán TNF polipeptidet kódol-e. A fenti módszerekkel olyan transzformált DNS-ekhez jutunk, amelyek a humán TNF mRNS bázisszekvenciájával komplementer DNS- ffagmenset tartalmazó rekombináns plazmidot fogadtak be. Ha a kapott klónozott cDNS-ek nem tartalmazzák a humán TNF polipeptid kódolásához szükséges teljes molekulaszakaszt, nagyobb méretű cDNS-eket úgy választhatunk ki a cDNS génállományból, hogy mintákét a transzformált DNS-ekből szelektált klónozott TNF cDNS-fragmenseket használjuk. A humán TNF polipeptid aminosavszekvenciáját tartalmazó polipeptidet kódoló klónozott cDNS-t végül úgy is előállíthatjuk, hogy a kapott klónozott cDNS-fragmensek bázisszekvenciáját például Maxam- 5 Gilbert módszerrel [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 560 (1977)] meghatározzuk, megkeressük a nyúl TNF cDNS bázisszekvenciájával homológ bázisszekvenciákat, és kiválasztjuk azokat a cDNS-eket, amelyek a humán TNF polipeptid teljes kódoló régiójának meg- 10 felelő bázisszekvenciát tartalmazzák. A nyúl TNF-et és a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciák közötti homológiát, valamint az ebből következtetett, nyúl TNF és humán TNF polipeptid aminosavszekvenciák közötti homológiát az 5. és 6. táblázatban mutatjuk be. 15 6. táblázat ___________________________________________10 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val 20 Glu Leu Ala Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ala Gly Pro Leu Pro Lys Lys Leu Pro Lys Lys------------------------w Felső sorok: humán TNF prekurzor t Alsó sorok: nyúl TNF prekurzor i 12
