202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 kialakítása céljából 0,7 %-os folyékony agarózzal lxTBE-ben lezárjuk. A mintával szemben egy darab NA45 membránt (Schleicher és Schuell, Dassel, BRD) illesztünk be és a DNS-t a membránon 300 V mellett 5 percen át elektroforézisnek vetjük alá. A DNS-t tartalmazó csíkot desztillált vízzel mossuk és 250 pl 1,5M lítium-acetátot, 50 mM trisz-HCl-t (pH 8,0) és lOmM EDTA-t tartalmazó Eppendorf-csőbe visszük át. A DNS-t 65 °C-on 20 percen át időnkénti örvényeltetés mellett eluáljuk. A membráncsíkot a csőből eltávolítjuk és a mintát 1 M trisz-pufferrel (pH 8,0) telített 200 pl fenollal egyszer extraháljuk. A mintákat mikrocentrifugában 10 percen át percenkénti 12 000 fordulat mellett centrifugáljuk, majd a DNS-t tartalmazó felül elhelyezkedő folyadékot elvezetjük. A DNS-t szárazjégen 20 pl 5 mólos lítium-acetát és 440 pl izopropanol hozzáadása után 10 percig kicsapjuk. A DNS-t mikrocentrifugában 10 percen át percenkénti 12000 fordulat mellett tömörítjük. A pelletet 80 %-os etanollal mossuk és vákuumban szárítjuk. A pelletet 10 pl TE-pufferben oldjuk (10 mmól Tris-HCl, pH 7,6; 1 mmól EDTA). D. pDS8/RBSII,SphI plazmid preparatív hasítása 2 pmól pDS8/RBSII,SphI plazmidot (400 p/ml) 10 egység SphI-gyel „magpufferben” 37 °C-on 50 pl térfogatban egy órán át emésztünk. Ezután 1 egység Scal-t adunk hozzá és az emésztést 30 percen át folytatjuk. A mintát emésztés után fenollal egyszer extraháljuk, éterrel kezeljük, kicsapjuk és a fent leírt módon szárítjuk. A pelletet 20 pl pufferben (50 millimól Trisz-HCl, pH 8) oldjuk, amely egy egység borjúbélfoszfatázt (CIP, Boehringer, Mannheim) tartalmaz és egy órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az enzimet hővel inaktiváljuk és a fehérjét eltávolítjuk (lásd fent), majd a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS újraszuszpendálása után a pDS8/RBSII,SphI-nek a Scal/Sphl ffagmensét (amely cat-gén, terminátor TI, replikációs eredet, bla gén, Pn25*/0 promoter és RBSÜ.Sphl riboszómás kötődési hely részeket tartalmaz) 1 %-os agaróz gélben elektroforézissel izoláljuk és elektroforetikus úton NA45 membránokra visszük át. Az utólagos eluálást, etanolos kicsapást és 100 pl TE-pufferben történő újraszuszpendálást a fentiek szerint végezzük el. Kb. 1 pmól vektor fragmenst kapunk. E. Plazmid pGLS összeállítása 2 pl vektor fragmenst 2 pl inzert DNS-sel (1 fragmens) ligálunk 1 pl DNS-ligázt (1 Weiss-egység, Boehringer, Mannheim) tartalmazó ligáz pufferben (lásd fent) 20 pl össztérfogatban. A ligálást 22 °C-on 3 órán át végezzük. Párhuzamosan inzert DNS nélkül kontroll ligálást hajtunk végre. A ligálást oly módon állítjuk le, hogy a mintákat 7 percen át 65 °C-on melegítjük. A transzformáláshoz felhasznált kompetens E.coli M15 sejteket Morrison módszerével készítjük el [Methods Enzymol. 68, 326-331 (1979)]. A ligációs keveréket a pDMI.l plazmidot befogadó felolvasztott kompetens E.coli M15 sejtekhez (200 pl) adjuk. A mintákat 30 percig jégre helyezzük, majd 42 *C-on 2 percen át inkubáljuk. Ezután 0,5 ml LB-táptalajt adunk hozzá és a mintákat 37 °C-os vízfürdőn 90 percen át inkubáljuk. A sejteket mikrocentrifugán percenkénti 12 000 fordulat mellett 30 másodpercen át centrifugáljuk. A felül elhelyezkedő folyadékot elvezetjük, a pelleteket lOOpl LB-táptalajban [Maniatis és tsai: „Molecular Cloning - A Laboratory Manual*, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 440. oldal] szuszpendáljuk és 100 pg/ml ampicillint + 25 pg/ml kanamicint tartal-mazó LB- agar lemezeken szélesztjük. A lemezeket egy éjjelen át 37 °C-on inkubáljuk. A kontroll ligálás transzformációja után nem kaptunk transzformátumot. Az 1. fragmens ligálása kb. 200 transzformátumot ad. Az egyes telepeket fogpiszkálóval felvesszük, 100 pg/ml ampicillint és 25 pg/ml kanamicint magában foglaló LB-táptalajt (100 ml) tartalmazó csövekbe visszük át és 37 'C-on erőteljes rázatás közben 12 órán át tenyésztjük. A sejteket 10 percen át percenkénti 8000 fordulat mellett centrifugáljuk. A DNS plazmidot Bimbóim és tsai módszerével extraháljuk [Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, (1979)]. A végső pelleteket 200 pl TE-pufferben oldjuk. 4 plt SphI és Xbal segítségével emésztünk, a TI terminátort magában fogalaló INF-y-gént tartalmazó fragmens felszabadítása céljából. Az összes megelemzett DNS minta felszabadítja a mintegy 1 kb várt nagyságú fragmenst. Ezeket a plazmidokat pGLS-nek nevezzük. F. pGLS-ben klónozott IFN-y-gén szekvencia analízise Annak igazolása céljából, hogy a helyes IFN-y szekvencia beillesztődött a pGLS-be, a kettősszálú köralakú DNS plazmid szekvenciáját a végén (y-32P)ATP-vel jelzett primer felhasználásával meghatározzuk. A primer a nukleotidokat a pDS8/RBSII,SphI 199-218. helyzetétől tartalmazza és ezért a SphI-hely ATG-je előtt 6 nukleotiddal végződik. 15 pl izolált DNS-t (0,3 pmól) etanollal lecsaunk és 80 %-os etanollal egyszer mosunk. A pelletet 2 percen át Speed vac koncentrátorban szárítjuk, majd a pelletet 8 pl 1/4 TE-pufferben oldjuk. Ezután 2 pmól, a végén (y- 32P)ATP-vel jelzett prímért adunk hozzá, majd a mintát 5 percen át 95 °C-on melegítjük és 5 percre 42 °C-os vízfürdőbe helyezzük. A fragmens szekvenciájának meghatározása céljából lényegében Sanger és tsai dideoxi-lánc-végződéses módszerét alkalmazzuk. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74, 5463-5467 (1977)], azzal a módosítással, hogy minthogy a primer radioaktív jelzett, a meghosszabbítási reakcióban jelzetlen deoxiribonukleotid- trifoszfátot (dXTPs) alkalmazunk. A szekvenciaadatok bizonyítják, hogy az immun interferon gén megfelelően illesztődött be a plazmid pGLS-be. 3. példa pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pIFN- y(-8), pIFN-y(-10) és pIFN-y(-ll) plazmidok felépítése A. Elvek A kívánt helyzetekben transzlációs stop kodonokat tartalmazó kémiailag szintetizált oligonukleotideket li-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
