202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 sonlóképpen más lehetséges variánsokat és az ezeknek megfeleld szekvenciákat is. A találmány tárgya hirudin előállítása élesztőkben. Az élesztők egysejtű eukarióta organizmusok. Az élesztők Saccharomyces nemzetsége olyan törzseket tartalmaz, amelyek biokémiáját és genetikáját intenzíven tanulmányozták a laboratóriumokban, ez magában foglal olyan törzseket is, amelyeket az élelmiszeriparban alkalmaznak (kenyér, alkoholos italok, stb.), és amelyeket következésképpen nagyon nagy mennyiségben állítanak elő. Idegen polipeptidek kifejezéséhez alkalmas gazdaszervezet a Saccharomyces cerevisiae, mivel a sejtek genetikailag könnyen manipulálhatók, akár klasszikus, akár géntechnológiai módszerekkel, vagy még inkább ennek a két technikának a kombinációjával, valamint ez a faj hosszú ipari múltra tekint vissza. A találmány tehát elsősorban egy olyan funkcionális DNS szakasz előállítására vonatkozik, amely lehetővé teszi, hogy hirudint állítsunk elő élesztőben; az említett DNS szakaszra az jellemző, hogy tartalmaz legalább- egy, a hirudinhoz vagy variánsainak egyikéhez tartozó gént (ezt a továbbiakban H génnek nevezzük); és- egy olyan DNS szekvenciát (Str), amely azokat a szignálokat tartalmazza, amelyek a H gén élesztők általi átírásáról gondoskodnak. Amikor egy élesztő, előnyösen Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztő egy plazmidjában vagy kromoszómáiban integrálódik, ez a funkcionális szakasz az említett élesztő transzformálása után lehetővé teszi, hogy a hirudin kifejeződjék vagy aktív formában, vagy olyan inaktív prekurzor formájában, amelyből a hirudin aktiválás hatására felszabadul. A Saccharomyces cerevisiae előnye az, hogy ez az élesztő képes bizonyos fehérjéket kiválasztani a tenyészközegbe. A kiválasztásért felelős mechanizmust széles körben tanulmányozták már, és kimutatták, hogy megfelelő manipulációkkal az élesztők olyan korrektül előállított humán hormonok kiválasztására késztethetők, amelyek minden tekintetben hasonlók a humán szérumban találhatókhoz (13, 14). A jelen találmánnyal összefüggésben ez a tulajdonság nagyon hasznos a hirudin kiválasztásának elérésében, mivel ez a lehetőség számos előnyt nyújt. Először is az élesztő kevés fehérjét választ ki, aminek az az előnye, hogy ha az adott idegen fehérje kiválasztásának irányítását magas szinten tudjuk elvégezni, a tenyészközegben termelendő terméket az összes kiválasztott fehérjére vonatkoztatva olyan nagy százalékos arányban kapjuk, ami jelentősen megkönnyíti a keresett fehérje tisztítását. Az élesztő számos fehérjét vagy polipeptidet választ ki. Az összes ismert esetben ezek a fehérjék hosszabb prekurzor formájában szintetizál ódnak, amelyeknek NH2-terminális szekvenciája kritikus a kiválasztáshoz vezető metabolikus útba való belépés szempontjából. Az ezen prekurzorok egyikének NH2-terminálisát és az ezt követő idegen fehérje szekvenciáját tartalmazó hibrid fehérjék szintézise élesztőben bizonyos esetekben ennek az idegen fehérjének a kiválasztásához vezethet. Az a tény, hogy ez az idegen fehérje prekurzor formájában szintetizálódik, amely ezért általában inaktív, lehetővé teszi, hogy a sejt védve legyen a keresett molekulák esetleges toxikus hatásai ellen; ezeknek a hasítása, amely az aktív fehérjét felszabadítja, csak a Golgi-apparátusból származó vesiculumokban megy végbe, amelyek a fehérjét a citoplazmától elválasztják. A kiválasztáshoz vezető ilyen metabolikus út alkalmazása, ami az élesztőt az idegen fehérje termelésére készteti, számos előnnyel jár: 1. lehetővé válik egy meglehetősen tiszta termék kinyerése a tenyészet felülúszójából; 2. lehetővé válik a sejt védelme az érett fehérje esetleges toxikus hatásai ellen; 3. ezentúl a kiválasztott fehérjéket adott esetekben alá lehet vetni bizonyos módosításoknak (glikozilezés, szulfatálás, és hasonlók). Ebből az okból a jelen találmány szerinti kifejeződő szakasz részletesebben a következő szerkezettel bír: — Str — Lex — ScL — H gén Az Lex kódolja a H génnek megfelelő fehérje kiválasztásához szükséges vezető szekvenciát; az ScL az a DNS-szekvencia, amely a hasítási helyet kódolja; ezenkívül az ScL - H rész többször is ismétlődhet. A kiválasztórendszer példájaként az alfa feromon rendszert választottuk, azaz a fenti szekvenciában az Lex szekvencia az élesztő alfa szex feromonjához tartozó génből származik, de más rendszereket is lehet alkalmazni (pl. a gyilkos fehérje rendszert). (13). Az élesztő alfa szex feromonja olyan peptid, amely 13 aminosavból áll (a 2. ábrában bekeretezve), és amelyet a MATa szex típusú S. cerevisiae élesztők a tenyészközegbe választanak ki. Az alfa faktor megragadja az ellenkező szextípus {MATa) sejteket a G1 fázisban, és a sejtek két típusának éréséhez szükséges biokémiai és morfológiai változásokat indukál. Kurjan és Herskowitz (16) klónozták az a-faktorhoz tartozó struktúrgént és arra a következtetésre jutottak ennek a génnek a szekvenciájából, hogy ez a 13 aminosavból álló a-faktor egy 165 aminosavból álló prekurzor előfehérje formájában szintetizálódik (2. ábra). A prekurzor egy 22 gyökből álló aminoterminális hidrofób szekvenciát tartalmaz (szaggatott vonallal aláhúzva), ezt követi egy 61 aminosavból álló szekvencia, amely 3 glikozilező helyet tartalmaz, végül ezt követi az afaktor négy másolata. A négy másolat térközt tartó („spacer”) szekvenciákkal van elválasztva és az érett fehérje a prekuizorból a következő enzimaktivitások eredményeképpen szabadul fel: 1. katepszin B típusú endopeptidáz, amely a Lys-Arg dipeptidek COOH oldalán hasít (a hasítási helyet széles nyilak jelölik); 2. karbopeptidáz B típusú exopeptidáz, amely az elmetszett peptid COOH végénél jelen levő bázisos gyököket hasítja le; 3. dipeptidil-aminopeptidáz („A”-ként ismert), amely eltávolítja a Glu-Ala és Asp-Ala gyököket. Ennek a prekurzomak a nukleotid-szekvenciája ezenkívül tartalmaz még 4 HindlII restrikciós helyet, amelyeket H nyíllal jelölünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
