202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 dékot, keményítő kivonatot, húskivonatot, malátakivonatot, savót és hasonlókat. Ezenkívül alkalmazhatunk szervetlen nitrogéntartalmú vegyületeket is, például ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot, ammónium-nitrátot, ammónium-foszfátot és hasonlókat. Ezeket a forrásokat használhatjuk önmagukban vagy kombinálva. Az említett szén- és nitrogénforrásokon kívül a tápközeg előnyösen egyéb elengedhetetlen faktorokat és serkentőket is tartalmaz, például ásványi anyagokat, aminosavakat, vitaminokat stb., amelyek a növekedést és az enzim indukciót elősegítik. Ezenfelül adagolhatunk a tápközeghez karbamidot és tiokarbamidot, hogy bizonyos esetekben a savas ureáz indukcióját segítsük. A tenyésztés alatti pH érték és habzás kézbentartására előnyös lehet maró alkálihidroxid-oldat, nátriumkarbonát-oldat vagy valamely kalciumsó hozzáadása. Inkubációs hőmérsékletként olyan hőmérsékletet választhatunk, amely megfelel a törzs növekedésének. Általában előnyösen végezhetjük a tenyésztést 15 és 55 °C, még előnyösebben 25 és 45 °C között. Az inkubációs időt úgy választjuk meg, hogy az elegendő legyen az organizmus növekedésére és a savas ureáz termelésére. Általában az időtartam 5 és 120 óra közötti. Ha a tenyésztést a fenti feltételekkel végezzük, a savas ureáz általában a mikroba sejtekben található. Ezért az élő sejteket, amelyeket a tenyésztő közegből centrifugálással, ülepítéssel, flokulálással vagy porózus polimer vagy kerámia membránon történő szűréssel választunk el, a következő műveletnek vagy műveleteknek kell alávetni: fagyasztásos, olvasztásos kezelés, homogenizáló kezelés, ultrahangos szétválasztás, ozmózis nyomáson alapuló kezelés, sejtfal membrán sejtbomlás, felületaktív anyagokkal végzett kezelés stb. Az így oldhatóvá tett enzimet ezután valamely szokásos enzimtisztító módszerrel megtisztítjuk. Ilyenek a protaminkezelés, frakcionális kicsapás, szerves oldószeres kezelés, izoelektromos fókuszálás, elektroforézis, ioncserélő kromatográfia, gélszűfés, affinitás kromatográfia, kristályosítás és hasonlók. így olyan enzimterméket kapunk, amely homogén, mint egy fehérje. Az enzimaktivitás kísérleti meghatározása A jelen találmányunkban említett ureáz aktivitásértékeket 37 °C- on pH 4,0-nál határoztuk meg a következő eljárással. Az enzimoldatból megfelelő hígításban 2 mlt 37 °C hőmérsékleten inkubáltunk, pontosan 5 percig. Ehhez a hígított enzimhez 2 ml 37 °C-ra előmelegített szubsztrátoldatot adtunk. A keveréket ráztuk, és a reakciót 37 °C hőmérsékleten pontosan 30 percig folytattuk. Közvetlenül a reakció után 4 ml 10 %-os triklór-ecetsavat adagoltunk az elegyhez, és azt centrifugáltuk (8000 fordiperc, 5 percig). A felülúszót (2 ml) elválasztottuk, és vízzel 20 ml-re egészítettük ki. Ebből az oldatból 4 ml-hez 2 ml A színező reagens oldatot adtunk, és enyhén kevertük. Ezután 2 ml B színező reagens oldatot adtunk az elegyhez és újra enyhén kevertük, majd a reakciót 37 °C-on 30 percig folytattuk. Ekkor szobahőmérsékleten meghatároztuk 640 nm-nél az elnyelést, összehasonlító mintaként vizet alkalmaztunk. Másrészt a fenti enzimhigításból 2 ml-t a szubsztrátoldat helyett 2 ml 0,2 mólos citrátpufferrel ráztunk, és a reakciót 37 °C hőmérsékleten pontosan 30 percig folytattuk. A kapott reakcióelegyet ugyanúgy kezeltük, mint a fentiekben, és így állítottuk elő az összehasonlító enzimmintát. Ezenfelül 2 ml standard ammóniumszulfát oldatot (50 pg/ml), 1 ml 10 %-os triklór-ecetsavat és 0,5 ml 0,2 mólos citrátpuffert 20 ml-re hígítottunk vízzel, és a kapott oldatot ugyanannak a festési előhívási eljárásnak vetettük alá, mint a fentiekben, és így kaptuk a standard oldatot. Másrészt 1 ml 10 %-os triklór-ecetsavat és 0,5 ml 0,2 mólos citrátpuffert 20 ml-re hígítottunk vízzel, és a kapott oldatot a fentiekben ismertetett színezési eljárásnak vetettük alá. így kaptuk a standard összehasonlító mintát. Az enzimaktivitást a következő egyenlettel határoztuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 Enzimaktivitás (U/mg) az enzimes oldat OD-ja - az összehasonlító enzimes oldat OD-ja . q 7^ . 4 . hígítást faktor ^_1_ a standard oldat OD-ja - a standard összehasonlító minta Od-ja ' enzimmennyiség (mg) 30 Egységnyinek fogadjuk el azt az enzimmennyiséget, amely 1 perc alatt 1 pmól NH3-at termel (1 U). A fenti meghatározási eljárásban alkalmazott reagenseket és vizsgálati oldatokat a következőképpen készítjük: A szubsztrátoldatot úgy készítjük, hogy 1,0 g karbamidot 0,2 mólos citrátpufferben oldjuk 100 ml-ig. A 10 %-os triklór-ecetsavat úgy készítjük, hogy 10 g triklór-ecetsavat vízben oldunk 100 ml-re. Az A színező reagens oldatot (fenol-nitroprusszid-nátrium oldat) úgy készítjük, hogy 5 g fenolt és 25 mg nitroprusszid-nátriumot vízben oldunk 500 ml-re. A B színező reagens oldatot (lúgos nátrium-hipoklorit oldat) úgy készítjük, hogy 5 g nátrium-hidroxidot és 7,5 ml nátrium-hipoklorit oldatot (effektiv klór koncentráció: 5 %) vízben oldunk 500 ml-re. A 0,2 mólos citrátpuffert úgy készítjük, hogy 25,18g citromsavat (monohidrátot) és 23,59 g nátrium-citrátot (dihidrátot) vízben oldunk 1000 ml-re (pH -4,0). A standard ammónium-szulfát oldatot (50 pg/ml) úgy készítjük, hogy lemérünk pontosan 250,0 mg ammónium-szulfátot, azt feloldjuk vízben 25(Lrnl térfogatra, majd ebből az oldatból 5 ml-t vízzel 100 ml-re hígítunk. A hagyományos ureáztól eltérően a találmány szerint előállított új ureáz pH optimuma a savas tartományba esik. Ezenfelül ez az ureáz felülmúlja a hagyományos ureázt pH-stabilitás, hőmérséklet-stabilitás és alkoholstabilitás szempontjából is. Ebből következik, hogy találmány szerint előállított ureáz kereskedelmi szempontból igen hasznos enzim. Például ennek az ureáznak a fajlagos aktivitása több mint 20 U/mg fehérje, és ezért kisebb mennyiségben is eléggé aktív ahhoz, hogy alkoholos oldatokból le-45 50 55 60 7
